原核基因表达及其调控.ppt

单一方向串连排列的基因在低拷贝质粒中表达多个串连排列的基因，以增加蛋白的表达量。限制性内切酶AvaI的应用：表达多个串连基因的表达载体的构建AvaI12强转录启动子和终止子；核糖体结合位点（RBS）的强弱；质粒载体及其质粒的拷贝数；是否整合到优良表达载体的性能合成的外源蛋白在细胞中的定位；宿主的翻译效率；克隆载体所表达的外源蛋白的稳定性。染色体DNA之上；含lac启动子的表达载体：多种。其最大的特点是带有编码lacZ（?-半乳糖苷酶）的编码序列。所有含lac启动子的表达载体都受到IPTG的诱导。当外源基因插入后，如果能够保持正确的ORF，就可以形成由外源基因编码的多肽和?-半乳糖苷酶组成的融合蛋白。03010204pOP203-13特点（1）为pBR322衍生质粒，插入了强启动子PlacUV5并在其下游加入了?-半乳糖苷酶的编码序列（?-gal）21bp片断和一个EcoRI位点；（2）其融合蛋白的N端为?-半乳糖苷酶的前7个氨基酸和EcoRI接头编码的少数几个氨基酸，其C端为完整的外源蛋白。pOP203系列表达载体：AfamilyofcloningvectorscontainingthelacUV5PromoterpOP203-1,2,3、pOP203-13、pOP203-24、pOP203-27、pOP203-28、pOP203-29表达载体pOP203质粒结构示意图产生的表达蛋白的量高于lac启动子；所有含trp启动子的表达载体都受到3-?-吲哚丙烯酸（IAA）的诱导。如：pDR7202、含trp启动子的表达载体：质粒载体pDR720结构示意图质粒pDR720是一个含trp启动子的表达载体，它来源于p51，trp启动子在SmaI位点插入，在启动子的下游有3个位点，SalI、BamHI和SmaI，可以插入外源基因。含tac启动子的表达载体：高表达效率启动子；受IPTG的诱导。多种商业化的载体。如：pKK223-3;pBADHis-A,B,C;pTrcHis-A,B,C;pSE420特点：1Ampr；2tac启动子；3lacZ核糖体结合部位；4ATG起始密码子，位于RBS下游8bp处；5来源于?-噬菌体的终止子T1和T2，以避免其它基因的过度转录。6是一种极强的启动子，所以被广泛用于各种载体的构建；如：pPL-?;来源于pBR322,pBR322的EcoRI/BamHI位点被PL和N基因取代；外源基因可以插入到N基因中的HpaI位点；当培养温度为29-31?C时，PL启动子处于阻遏状态；但当温度升到42?C，发生脱阻遏。4、含PL启动子的表达载体：质粒载体pPL-?结构示意图（三）提高蛋白质的表达量某些表达载体被构建用于增加蛋白质的表达量，例如，pPLc2833:（1）强启动子；（2）选择性标记；（3）多克隆位点（MCS）其衍生质粒pCP3的构建：将pPLc2833的复制起始位点替换为另一个质粒pKN402。质粒pKN402的复制起始位点是耐温型的，在42?C时仍然有很强的复制起始的功能。01.连接02.电泳后回收片段1和3电泳后回收片段c温度对3种表达载体质粒拷贝数的影响由于pKN402和pCP3的复制子在42?C时仍然具有很强的起始复制能力，因此当培养温度升高到42?C时，细胞中的pKN402和pCP3的拷贝数要比pPLc2833高5～10倍。（四）大规模培养系统小规模培养（1～5L）含表达载体的重组菌株时，其调控可以直接向培养基中添加诱导物，或者升高温度，但是在半工业化（20～200L）或者工业化大规模（大于200L）生产时，不能采用小规模的方法：（1）直接向培养基中添加诱导物如IPTG，由于需要量较大，成本高，不经济；（2）即使是使用温度敏感的表达载体，升高温度既需要较长的时间，又需要很大的能源消耗，成本也很高。一种解决的途径：使用“双质粒系统”：用trp启动子带动编码cI阻遏蛋白的基因，然后将它们置于一个弱启动子的载体上；将要表达的外源基因置于强