叶绿体的分离及荧光观察.pptVIP

(一)呼吸抑制剂这类抑制剂抑制呼吸链的电子传递，也就是抑制氧化，氧化是磷酸化的基础，抑制了氧化也就抑制了磷酸化。(二)磷酸化抑制剂这类抑制剂抑制ATP的合成，抑制了磷酸化也一定会抑制氧化。(三)解偶联剂(uncoupler)解偶联剂使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶联剂作用的本质是增大线粒体内膜对H+的通透性，消除H+的跨膜梯度，因而无ATP生成，解偶联剂只影响氧化磷酸化而不干扰底物水平磷酸化，解偶联剂的作用使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。根据1924年Svedberg（离心法创始人--瑞典蛋白质化学家）对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。

沉降系数以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为1～200×10-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S，即1S=10-13秒，如血红蛋白的沉降系数约为4×10-13秒或4S。分辨率在颗粒测试中有两个定义：

分辨率：把密度值或沉降系数相差不大的颗粒分开的能力等密度离心分离样品主要是根据被分离样品的密度。在这种离心分离方法中，要用介质产生一种密度梯度，这种密度梯度覆盖了待分离物质的密度，这样，通过离心使不同密度的颗粒悬浮到相应的介质密度区。在这种梯度离心中，颗粒的密度是影响最终位置的惟一因素，因此用这种方法分离颗粒，主要是根据被分离颗粒的密度差异。只要被分离颗粒间的密度差异大于1%就可用此法分离。

蔗糖或者甘油(它们的最大密度是1.3g/cm3)通常可用于分离膜结合的细胞器，如高尔基体、内质网、溶酶体和线粒体。在等密度梯度离心中蔗糖或甘油的梯度的作用与移动区带离心中梯度原理是不同的，在移动区带离心中梯度的惟一目的是减少样品的扩散，即使是在离心管的底部，颗粒的密度也比介质大。相反，在等密度梯度离心中，使用的密度是足以阻止颗粒移动的密度，当颗粒达到与本身密度相同的密度区时就会停留在该区域。

离心分离密度大于1.3g/cm3的样品，如DNA、RNA，需要使用密度比蔗糖和甘油大的介质。重金属盐氯化铯(CsCl)是目前使用的最好的离心介质，它在离心场中可自行调节形成浓度梯度，并能保持稳定。在氯化铯形成的密度梯度中，离心管顶部的密度为:1.65g/cm3，底部为:1.75g/cm3。因为DNA的密度是1.70g/cm3，会停留在离心管的中部。速率区带离心速率区带离心法是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。离心后在近旋转轴处（X1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（X2）介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。?由于ρP＞ρm可知S＞0，因此该离心法的离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。常用的梯度液有。

荧光显微镜就其光路来分有两种：

1．透射式荧光显微镜激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的(图2—5)。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观察较大的标本材料较好。

2．落射式荧光显微镜这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜(图2—6)。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45。角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。

外加分子与荧光体分子相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭叶绿体DNA由Ris和Plaut1962最早发现于衣藻叶绿体。

ctDNA呈环状，长40~60μm，基因组的大小因植物而异，一般约200Kb-2500Kb。数目的多少植物的发育阶段