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碘柱前衍生-高效液相色谱法快速测定粮食中黄曲霉毒素

一、1.引言

(1)黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）是一类由黄曲霉等多种霉菌产生的次级代谢产物，广泛存在于谷物、油料、坚果等粮食作物中。其中，B1型黄曲霉毒素是已知的毒性最强、致癌性最高的真菌毒素，长期摄入可导致肝脏损害、肝细胞癌变等严重疾病。据世界卫生组织（WHO）和国际癌症研究机构（IARC）的报告，黄曲霉毒素B1被列为1类致癌物。随着全球粮食贸易的扩大和粮食储藏条件的复杂化，黄曲霉毒素污染已成为食品安全领域的重要问题。据我国食品安全风险评估中心数据显示，我国每年因黄曲霉毒素污染导致的粮食损失高达数百万吨，直接经济损失巨大。

(2)为了确保粮食安全，保障人民群众身体健康，我国制定了严格的标准对粮食中的黄曲霉毒素进行限量检测。根据我国《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》（GB2761-2017）规定，玉米、花生等粮食产品中黄曲霉毒素B1的限量分别为≤20ng/g和≤10ng/g。高效液相色谱法（HPLC）因其分离效率高、灵敏度高、应用范围广等优点，已成为粮食中黄曲霉毒素检测的常规方法。然而，传统的HPLC检测方法存在样品前处理步骤繁琐、分析时间长等缺点，难以满足快速检测的需求。

(3)近年来，随着色谱技术、衍生化技术和自动化技术的发展，柱前衍生-高效液相色谱法（Pre-columnDerivatization-HPLC）在粮食中黄曲霉毒素的快速检测中得到了广泛应用。该方法通过在样品前处理中加入特定的衍生化试剂，使黄曲霉毒素分子结构发生变化，从而提高检测灵敏度和选择性。据统计，柱前衍生-高效液相色谱法检测粮食中黄曲霉毒素的检出限可达0.5ng/g，显著优于传统HPLC方法的检出限。此外，结合自动化进样、检测等设备，柱前衍生-高效液相色谱法可实现粮食中黄曲霉毒素的快速检测，分析时间可缩短至30分钟以内。这对于提高粮食质量安全监管效率、保障人民群众饮食健康具有重要意义。

二、2.方法原理

(1)柱前衍生-高效液相色谱法（Pre-columnDerivatization-HPLC）是粮食中黄曲霉毒素检测的一种重要方法。该方法首先通过样品前处理，如提取、净化等步骤，将黄曲霉毒素从复杂样品基质中分离出来。提取过程中，常用的溶剂有乙腈、甲醇等，它们能有效溶解黄曲霉毒素，同时减少样品基质对色谱柱的污染。净化步骤通常包括固相萃取（SPE）或液-液萃取，以去除干扰物质，提高检测的灵敏度和选择性。

(2)在样品前处理后，黄曲霉毒素分子需要通过衍生化反应进行结构修饰，以便于后续的高效液相色谱分析。衍生化反应通常涉及将黄曲霉毒素的极性基团转化为易于检测的荧光或紫外吸收基团。例如，B1型黄曲霉毒素的衍生化反应通常使用4-甲基香豆素-7-磺酸（Methoxyamine-HCl）作为衍生化试剂，衍生化产物在紫外光下具有特征吸收峰，便于检测。衍生化反应的温度、时间和pH值等条件对衍生化产物的形成和检测灵敏度有重要影响。

(3)在高效液相色谱分析中，衍生化后的黄曲霉毒素通过液相色谱柱进行分离。色谱柱的选择对分离效果至关重要，常用的色谱柱材料有C18、C8等。流动相通常由水和有机溶剂（如乙腈或甲醇）组成，通过调整流动相的组成和pH值，可以优化分离效果。检测器方面，荧光检测器因其高灵敏度和特异性，常被用于黄曲霉毒素的检测。通过优化色谱条件，如流速、柱温等，可以实现对黄曲霉毒素的快速、准确检测。例如，使用高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）对粮食样品中的黄曲霉毒素B1进行检测，其检出限可达0.5ng/g，满足食品安全标准的要求。

三、3.实验部分

(1)实验采用玉米样品作为研究对象，样品采集自我国不同地区的粮食市场，共计30个批次。样品经预处理后，首先进行黄曲霉毒素的提取。提取过程中，取5g样品加入50mL乙腈，超声处理30分钟，以充分提取黄曲霉毒素。提取液经离心后，取上清液进行固相萃取净化。固相萃取柱使用C18小柱，用10mL水活化，然后用10mL乙腈平衡，上样流速控制在1mL/min。净化后的样品溶液经氮气吹干，残渣用1mL流动相复溶，待检测。

(2)柱前衍生化反应在室温下进行，将复溶后的样品溶液中加入50μL4-甲基香豆素-7-磺酸（Methoxyamine-HCl）和100μL三氟乙酸（TFA）溶液，混匀后置于60℃水浴中反应30分钟。反应完成后，加入100μL正己烷，振荡提取衍生化产物。正己烷层转移至新的试管中，用氮气吹干，残留物用100μL流动相复溶，待高效液相色谱检测。

(3)高效液相色谱分析采用C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），流动相为乙腈-水（梯度洗脱），流速为1.0mL/min，柱温为30℃。荧光检测器激发波长为365