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一种分子伴侣共表达提高蔗糖磷酸化酶表达效率的方法[发明专利]

一、背景技术

(1)蔗糖磷酸化酶（SucrosePhosphateIsomerase，SPI）是一种重要的工业酶，在生物燃料、食品加工和医药领域具有广泛的应用。SPI能够将蔗糖转化为果糖和葡萄糖，这一过程对于提高糖类物质的利用率具有重要意义。然而，传统发酵生产SPI存在表达效率低、产量不稳定等问题，限制了SPI在工业生产中的应用。研究表明，SPI的表达受到多种因素的影响，包括宿主细胞的遗传背景、表达系统的优化、诱导条件的选择等。

(2)分子伴侣（Chaperones）是一类蛋白质，它们能够辅助新合成蛋白质的正确折叠、运输和组装，从而提高蛋白质的稳定性和活性。近年来，研究发现分子伴侣在提高蛋白质表达效率方面具有重要作用。例如，Hsp70是一种广泛存在的分子伴侣，能够与目标蛋白结合，降低其折叠过程中的聚集风险，提高蛋白的折叠效率和表达水平。在SPI的表达过程中，加入分子伴侣可以改善SPI的折叠和组装，从而提高其表达效率。据文献报道，Hsp70与SPI共表达能够将SPI的表达水平提高约30%。

(3)为了进一步提高SPI的表达效率，研究人员尝试了多种表达系统的优化策略。其中，大肠杆菌（Escherichiacoli）是常用的表达宿主，因其繁殖速度快、遗传背景清楚等优点。然而，大肠杆菌自身缺乏SPI的折叠伴侣，导致SPI在细胞内以错误折叠的形式存在，从而降低了其活性。针对这一问题，研究人员通过构建融合蛋白表达系统，将SPI与分子伴侣融合表达，以期提高SPI的折叠效率和表达水平。例如，将SPI与Hsp70融合表达，可以显著提高SPI的活性，使其在发酵液中的活性提高约50%。此外，通过优化发酵条件、选择合适的诱导剂和培养基成分等方法，也可以进一步提高SPI的表达效率。

二、发明内容

(1)本发明提供了一种提高蔗糖磷酸化酶（SPI）表达效率的方法，该方法通过共表达一种分子伴侣蛋白，如热休克蛋白70（Hsp70），以改善SPI的折叠和组装，从而提高其在宿主细胞中的表达水平。该方法特别适用于大肠杆菌等表达系统，能够显著提升SPI的产量和活性，满足工业生产对SPI的需求。

(2)本发明的方法包括以下步骤：首先，设计并合成一个融合蛋白，该融合蛋白由SPI基因与分子伴侣基因（如Hsp70基因）拼接而成。接着，将融合蛋白基因克隆到表达载体中，并转化到大肠杆菌等宿主细胞中。然后，通过优化发酵条件，如温度、pH值、营养物质和诱导剂浓度等，以促进融合蛋白的表达。最后，通过蛋白纯化技术从发酵液中提取纯化的SPI，并通过生物活性测试验证其表达效率和活性。

(3)本发明的方法具有以下优点：首先，共表达分子伴侣能够有效降低SPI的错误折叠，提高其正确折叠率，从而增加SPI的活性。其次，该方法能够显著提高SPI的表达水平，相较于传统表达系统，SPI的表达量可提高50%以上。此外，本发明的方法操作简便，易于实现工业化生产，有助于降低生产成本，提高经济效益。本发明的方法在生物燃料、食品加工和医药等领域具有广泛的应用前景。

三、技术方案

(1)本技术方案采用基因工程方法，首先通过PCR扩增获得蔗糖磷酸化酶（SPI）的编码基因，并克隆到表达载体中。同时，选择一种分子伴侣基因，如热休克蛋白70（Hsp70），与SPI基因进行融合表达。该融合基因构建完成后，通过大肠杆菌等表达系统进行表达。

(2)在发酵过程中，通过优化培养基成分、温度、pH值和诱导剂浓度等条件，以提高融合蛋白的表达量。例如，在37℃、pH7.0的条件下，使用0.5mM的异丙醇作为诱导剂，可以显著提高SPI-Hsp70融合蛋白的表达量，使其达到原SPI表达量的1.5倍。此外，通过添加适量的葡萄糖、氨基酸和维生素等营养物质，可以进一步优化发酵条件，提高SPI的产量。

(3)表达的SPI-Hsp70融合蛋白经过细胞破碎、离心和蛋白质纯化等步骤，得到高纯度的SPI。通过SDS电泳分析，SPI-Hsp70融合蛋白的分子量约为70kDa，与预期的分子量相符。通过活性测试，SPI-Hsp70融合蛋白的活性比未融合的SPI提高了40%。这一结果表明，共表达分子伴侣能够有效提高SPI的表达效率和活性，为SPI的工业化生产提供了新的技术途径。

四、实施例

(1)实施例一：选取大肠杆菌BL21（DE3）作为宿主细胞，构建了SPI与Hsp70融合表达载体。通过PCR扩增SPI和Hsp70基因，分别克隆到pET-28a表达载体中，构建成融合表达载体pET-SPI-Hsp70。将载体转化到BL21（DE3）中，通过IPTG诱导表达。在优化发酵条件下，SPI-Hsp70融合蛋白的表达量达到1.2mg/mL，比未融合的SPI表达量提高50%。通过