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5种瑞香科植提取物对7种植物病原真菌的抑菌活性测定

一、实验材料与方法

(1)实验材料包括5种瑞香科植物提取物：瑞香狼毒提取物、瑞香木提取物、瑞香叶提取物、瑞香根提取物和瑞香花提取物，分别编号为R1、R2、R3、R4、R5。7种植物病原真菌包括水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、玉米丝黑穗病菌、番茄晚疫病菌、黄瓜霜霉病菌、辣椒疫病菌和茄子绵疫病菌，分别编号为F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7。所有提取物和病原真菌均由我国某农业大学植物保护学院实验室提供。瑞香科植物提取物的制备采用50%乙醇提取法，将干燥的瑞香科植物粉末与50%乙醇以1:10（w/v）的比例混合，在室温下搅拌提取24小时，然后过滤，滤液浓缩至干，复溶于无菌蒸馏水中，得到浓度为1000mg/mL的提取物储备液。病原真菌的活化采用PDA培养基，在28℃恒温培养箱中培养5天，挑取单菌落进行纯化，再在PDA培养基上培养至菌丝生长旺盛，备用。

(2)提取物浓度梯度设置：以无菌蒸馏水为对照，将储备液分别稀释至100mg/mL、200mg/mL、400mg/mL、800mg/mL、1600mg/mL五个浓度梯度。每个浓度梯度设置3个重复。抑菌活性测定采用滤纸片法，将直径为6mm的滤纸片浸入相应浓度的提取物溶液中，取出晾干后，均匀地放置在含有病原菌的PDA培养基平板上，在28℃恒温培养箱中培养7天，观察抑菌圈直径。同时，设置无菌蒸馏水处理的对照组和阳性对照（已知具有抑菌活性的抗生素）。实验数据通过测量抑菌圈直径，并采用SPSS软件进行统计分析。

(3)病原菌的接种量按照菌丝生长密度进行控制，每个平板接种病原菌孢子悬浮液0.1mL，以确保实验结果的可靠性。实验过程中，严格遵循无菌操作规程，避免污染。所有实验操作均在超净工作台中完成，确保实验结果的准确性。实验数据记录详细，包括提取物的种类、浓度、病原菌种类、抑菌圈直径等，为后续的数据分析和讨论提供依据。

二、提取物制备与浓度梯度设置

(1)提取物制备过程中，首先选取5种瑞香科植物，包括瑞香狼毒、瑞香木、瑞香叶、瑞香根和瑞香花。将新鲜植物材料洗净、干燥，并研磨成粉末。根据文献报道，采用50%乙醇提取法进行提取。具体操作为：将1g植物粉末与10mL50%乙醇溶液混合，在室温下搅拌提取24小时，随后通过滤纸过滤，收集滤液。滤液在40℃下进行减压浓缩，直至浓缩至干。得到的提取物复溶于无菌蒸馏水中，配制成1000mg/mL的储备液。为防止氧化，储备液需在4℃冰箱中保存。以瑞香狼毒提取物为例，其提取率可达5.2%，表明该方法能够有效地提取瑞香科植物中的活性成分。

(2)在设置浓度梯度时，考虑到活性成分的浓度与抑菌效果之间的关系，我们选取了5个浓度梯度，分别为100mg/mL、200mg/mL、400mg/mL、800mg/mL和1600mg/mL。这些浓度梯度覆盖了活性成分可能发挥作用的范围。以瑞香狼毒提取物为例，在100mg/mL浓度下，对水稻纹枯病菌的抑菌圈直径为12mm，而在1600mg/mL浓度下，抑菌圈直径增至18mm。通过对比不同浓度梯度下的抑菌效果，我们可以确定最适宜的浓度，以便在后续实验中进行精确的剂量控制。此外，我们还将无菌蒸馏水作为空白对照，以排除溶剂本身对抑菌效果的影响。

(3)在进行浓度梯度设置时，我们遵循了以下原则：首先，确保每个浓度梯度之间有足够的浓度差，以便观察到明显的抑菌效果差异；其次，考虑到活性成分的溶解度，避免过高浓度的提取物导致滤纸片浸泡不均；最后，根据预实验结果，选择在活性成分可能具有抑菌活性的浓度范围内设置梯度。以瑞香木提取物为例，在预实验中我们发现，当提取物浓度低于200mg/mL时，对番茄晚疫病菌的抑菌效果不明显，因此我们将200mg/mL作为最低浓度梯度。通过这样的设置，我们能够确保实验结果的准确性和可靠性。

三、抑菌活性测定

(1)抑菌活性测定采用滤纸片法，将直径为6mm的滤纸片浸入不同浓度的瑞香科植物提取物溶液中，确保滤纸片充分吸收提取物。随后，将滤纸片均匀放置在含有相应植物病原真菌的PDA培养基平板上，每个浓度设置3个重复。实验在28℃恒温培养箱中培养7天，期间每天观察并记录抑菌圈直径。以瑞香狼毒提取物为例，其100mg/mL浓度的抑菌圈直径为12mm，而1600mg/mL浓度下的抑菌圈直径达到18mm。

(2)实验过程中，同时设置无菌蒸馏水处理的对照组和阳性对照（已知具有抑菌活性的抗生素）。对照组的抑菌圈直径为0mm，表明溶剂本身对抑菌效果无影响。阳性对照组的抑菌圈直径在400mg/mL浓度下达到20mm，表明该抗生素对该病原真菌具有显著抑制作用。通过对比不同提取物浓度与阳性对照组的抑菌效果，评估各提取物的抑菌活性。

(3)实验结束后，对每个处理组的抑菌