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数字PCR技术原理与临床应用

卢忠心

武汉市中心医院

2023.6

PCR技术的发现

Ø聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）

Ø是一种在体外条件下，利用DNA聚合酶模拟体内核

酸复制过程，催化一对引物间的特异核酸片段合成的

技术

Ø1983年由美国化学家KaryMullis发明

Ø1993年获得诺贝尔化学奖

PCR技术原理

•以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，

通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与

母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

•PCR通常需要进行30-40循环，每一循环可使

DNA的数量增加一倍，经过n次循环后，反应

n

混合物中所含DNA数量为2.

PCR技术分类

普通PCR

p经典方法

p仪器、试剂成本较低

pPCR产物可以回收后用于其他分子生物学实验

缺点：

•容易污染

•只能定性或半定量分析

•灵敏度中等

•无法区分长度相同的非特异性扩增条带与目的片段

荧光定量PCR(qPCR)

p由美国PerkinElmer公司于1995年研发的核酸定量技术

p利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精

确的对起始模板的定量分析

p成熟、简单、高灵敏、高特异

缺点

p相对定量

p目的基因发生突变易漏检

p低浓度模板检测结果无法确定

数字PCR

Ø数字PCR即digitalPCR（dPCR)能检测DNA分子的个数，是一种核酸分子绝对定量技术；

•将传统PCR的反应空间离散为以微液滴为代表的众多的、微小的反应空间，通过对微液

滴内反应结果的检测，基于泊松分布模型的统计分析，反映体系的原始模板拷贝数；

•基于这种核酸定量检测原理，数字PCR能够实现不依赖标准曲线的绝对定量，同时具有

更高的灵敏度、精度和抑制剂耐受性。

数字PCR

数字PCR包括PCR扩增和荧光信号分析两个部分：

•PCR扩增阶段：将样品稀释至单分子水平，再平均分配到几十至几万个单元中进行反应；

•荧光信号分析阶段：与qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法不同，dPCR是在扩增

结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，根据阳性比例和反应器的体积，就可以推

算出原始溶液的核酸浓度。

数字PCR原理

p根据泊松分布和阳性比例来计算核酸数量

采用泊松概率分布公式(Poissondistribution)进行计算：

p{X=k}=(λ^k/k!)*[e^(-λ)]，k=0、1、2…

λ：每个反应单元中所含目标DNA分子的平均拷贝数

m：稀释倍数决定

c：样品的原始拷贝数，λ=cm

p：在一定的λ条件下，每个反应单元中所含k个拷贝目标DNA分子的概率

当k=0(不含目标DNA分子)时，上式可简化为p=e-λ=e-cm，p可以看作是无荧光信号的反应单

元数与反应单元总数的比值，即

n：反应单元总数

f：有荧光信号的反应单元数

因此，根据n、f和m即可得到样本的最初拷贝数c=ln⁡(1−

数字PCR特点

Ø绝对定量：无需标准曲线和内参基因，有限稀释的单分子扩增，以信号有无作

为判断标准

Ø高精度：检测微小差异、稀有突变

Ø高灵敏度：广泛应用于低丰度靶标、拷贝数变异分析和复杂样本基因表达检测

Ø高重复性：对抑制物强耐受，避免了PCR抑制剂及不同核酸分子扩增产物间的

相互干扰（仅对高度稀释的微反应体系中的单分子扩增进行判读）

Ø高通量：多指标同时检测，显著降低检测成本

dPCR可以实现痕量核酸的高灵敏检测

dPCR的多指标并行检测的实现方式

数字PCR与qPCR的比较

qPCR