原生质体制备和转化.ppt

LogoLogoLogoLogo琉基化合物能松动细胞壁的蛋白质结构，有利于酶解产生大量原生质体硝酸钠3g磷酸氢二钾1g硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g琼脂20g蒸馏水1000mL玻璃板。4000r/min或6000r/min,时间可以稍微长一点。PBA可换成高渗缓冲液0.8mol/L离心洗涤两次。1.0mol/L的山梨醇作为稳定剂（真菌原生质体可以在用NaCl、MgSO4、甘露糖或最常用的山梨醇和蔗糖维持渗透压的条件下保持稳定，并且可以在-70℃冰箱冷冻保存使用菌丝体酶解后（约3h），立刻加入等体积量的山梨醇洗涤液，目的在于扩大酶解液体积，降低酶浓度，减少其对原生质体的损害菌丝体酶解后（约3h），立刻加入等体积量的山梨醇洗涤液，目的在于扩大酶解液体积，降低酶浓度，减少其对原生质体的损害1mol/L山梨醇换成NaCl.过滤换成离心。2000r/min或4000r/min.0.8MNaCl-50mMCaCl2山梨糖醇可换成蔗糖，用双层培养基。酶液用NaCl配常用无机稳渗剂有KCl、MgSO4、NaCl等，常用有机稳渗剂有蔗糖、葡萄糖、山梨醇等，本实验选用0.8MNaCl做为稳渗剂；双层培养基上长出的菌落比单层培养基上长出的菌落大且均匀,原生质体在双层培养基上更易同步生长。原因是双层培养法在原来培养基的基础上又倒1层半固体培养基,使原生质体处于半固体培养基的包埋中,从而使其免受机械损伤,保证原生质体的完整性,而且原生质体本身比较脆弱,在半固体培养基上更易于再生。一般认为,原生质体制备时无机盐作为高渗稳定剂的效果较好[7]。但该试验菌株在有机化合物为稳定剂的培养基上原生质体形成率明显高于无机盐,说明甘露醇、蔗糖等有机物并没有影响酶与菌体细胞的接触文献汇报培养基成分高渗溶液（有机/无机）缓冲液的pH（5.8-7.4）酶解条件（时间/各种酶的比例）酶液用高盐还是高渗缓冲液配擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体双层or单层培养基高渗缓冲液：CompanyLogo《微生物学实验教程》周德庆（酵母）1、接种于液体培养基上培养。2、取培养液10ml，4000r/min离心5min,弃上清液，用Tris-HCl(pH7.4)、0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。3、用含10mmol/L巯基乙醇的高渗缓冲液稀释裂解酶液。4、加酶液，100r/min摇床50-100min酶解。脱壁效果达70%左右即停止酶解。5、100r/min离心三分钟，去沉淀，取上清。再2000r/min离心10min收集沉淀原生质体。6、高渗缓冲液洗涤2次，2000r/min离心10min收集原生质体，最终用1ml高渗缓冲液悬浮原生质体。高渗缓冲液：蔗糖0.5mol/L,MgCl210mmol/L,Tris-HCl(pH7.4)10mmol/L原生质体混合、PEG助融双层平板：底层10ml的固体培养基（1.2%琼脂），将样品加入5ml融化后的半固体培养基（0.6%琼脂，预保温42℃）中，快速混合，导入铺有底层培养基的平板上。待上层凝固后，置于恒温箱培养《工业微生物育种学》施巧琴吴松刚*菌丝培养基：1、葡萄糖蛋白胨培养基2、PDA培养基（一种普遍用于酵母菌和霉菌计数培养用的培养基，被推荐用于各类食品和饮料中酵母菌和霉菌检测和计数）3、査氏培养基（用于真菌的分离鉴定，霉菌、白色念珠菌、酵母等微生物）*再生培养基：同查氏培养基，其中含NaCl浓度为0.8mol/L缓冲液：磷酸氢二钠-柠檬酸溶液01高渗溶液：0.6mol/LNaCl溶液02酶溶液：蜗牛酶、纤维素酶，用0.7mol/L的NaCl配制，G6砂芯漏斗抽滤除菌03取107个/mL的单孢子悬浮液，涂布于平板表面的玻璃纸上，培养后用无菌镊子将培养菌丝体的玻璃纸转移并倒复在已配好的酶液内，轻轻抖动玻璃纸，菌丝体散落在酶液中，然后去玻璃纸，酶解，定时取样观察。（该法收集的菌丝体会十分干净，免去了洗涤、离心等手续，减少对菌丝的伤害和杂菌污染）酶解1-2h，将培养皿内破碎菌丝体和原生质体混合液用吸管吹吸数次，用G2或G3砂芯漏斗过滤，使原生质体同菌丝体碎片分开，滤液1500-2000r/min离心10min，洗涤去上清，悬浮于同一高渗溶液中。再将含有原生质体的滤液用再生培养基洗涤三次，以清除酶液，然后用保存液悬浮。血球计数板计数，冷藏备用。双层平板，再生，计算原生质体再生率。林艳学姐：CompanyLog