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DB14/T1177—2016
大田转基因棉花外源序列PCR检测规程
1范围
本标准规定了大田转基因棉花外源序列PCR检测的术语和定义、试剂仪器材料、样品DNA提取、PCR检测基因及序列、PCR反应程序及电泳检测、样品分析结果以及检测档案记录。
本标准适用于大田种植的山西省审定棉花品种中转外源序列相关成份的检测鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB4407.1经济作物种子第1部分：纤维类
NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673转基因植物及其产品检测抽样
NY/T1297农作物品种审定规范棉花NY/T2162棉花抗棉铃虫性鉴定方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
转基因棉花
棉花自然遗传存在的基因组序列除外，另包含有经人工分离或修饰的基因序列，该序列是通过生物技术手段导入并整合到棉花基因组中，以控制某一功能或性状发生为目的，最终导致棉花基因组序列发生变化的棉花植株、棉花种子及作为亲本遗传产生的后代。
3.2
外源基因
在转基因棉花中，棉花自然遗传进化存在的基因除外，包含有经过生物技术手段导入的、人工分离修饰得到的基因序列，统称为外源基因。经人工分离修饰基因来源可包括棉花在内的任何生物，该基因通常以控制某一功能或性状发生。
3.3
外源序列
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DB14/T1177—2016
在转基因棉花中，棉花自然遗传进化存在的基因组核苷酸序列除外，包含有经过生物技术手段导入的、人工分离修饰得到的基因组核苷酸序列，统称为外源序列，该人工分离修饰基因组核苷酸序列可包括棉花在内的任何生物。通常包括有基因、调控基因表达的启动子、终止子、相关的常规调控序列区域以及非功能序列组成等。
3.4
内标基因Sad1
Stearoyl-acylcarrierproteindesaturase英文的缩写，指棉花自然遗传存在的基因序列，编码棉花硬脂
-酰基载体蛋白脱饱和酶的基因。3.5
PCR
PolymeraseChainReaction英文的缩写，即聚合酶链式反应；是一种基于DNA双螺旋分子的特点，利用核苷酸扩增仪通过一个包括DNA序列变性、退火引物与模板链结合、目标序列延伸的不断循环的过程来特定扩增目标DNA片段的分子生物学技术。
4试剂仪器材料
4.1试剂
4.1.1DNA提取及电泳常规用试剂
葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巯基乙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、盐酸（Hcl）、琼脂糖
4.1.2PCR扩增常规试剂
Taq酶、dNTP、loadingbuffer
4.2仪器
电子称、移液枪、高速离心机、水浴锅、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、振荡器
4.3材料
待检测的棉花材料；阴性对照非转基因棉花样本，阳性对照为转基因棉花样本。取样标准为新生顶端幼嫩新叶0.2g～0.4g，取样后按名称标记，冰上保存，-80℃冰箱保存备用。
5样品DNA提取
5.1棉花DNA提取液配制
5.1.11mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）
称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL纯净水中，用浓盐酸溶液调pH值至8.0，用纯净水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备用。
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DB14/T1177—2016
5.1.20.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）
称取18.61g乙二胺四乙酸二钠溶解于800mL纯净水中，用NaOH调节pH值至8.0，用纯净水定容至
1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备用。5.1.310%聚乙烯吡咯烷酮溶液
称取100g聚乙烯吡咯烷酮溶解于800mL纯净水中，定容至1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备用。
5.1.4DNA提取缓冲液
称取69.36g葡萄糖于1L烧杯，加500mL纯净水，充分溶解后，加入100mL1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，10mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，200mL10%聚乙烯吡咯烷酮溶液，10mLβ-巯基乙醇，充分混匀，用纯净水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备用。
5.2
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