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免疫组化（IHC）标准化

云南省第三人民医

院病理科

徐开军

免疫组化（IHC）是病理诊断的主要辅助手段之一。虽然免疫组化在各个实验室已经常规开

展，但是由于各个实验室选择的抗体试剂厂家、抗原修复方法、检测系统等不同，免疫组化

实验技术操作方法亦不相同，染色结果会出现各种差异。免疫组化染色技术操作步骤看似简

单，但步骤较多且环环相扣，而且许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练

掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、检测方法的敏感性、组织标本的固定、抗原的修

复及修复液的PH值等众多因素。所以，完成一张满意的免疫组化切片并非那么简单。20

世纪末，非生物素型聚合物（Polymer）检测系统的出现，可以有效地防止内源性生物素的

干扰，而且灵敏度高，操作便捷，已被免疫组化实验室广泛应用。当前，免疫组化技术标准

化的讨论是建立在由福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片并使用非生物素型聚合物检测方法

的基础上而展开的。

1、免疫组化染色前的处理：组织的固定、取材、脱水、包埋、切片与展片、烤片、脱蜡。

（1）组织的固定：固定的目的是防止组织、细胞自溶与腐败，凝固或沉淀组织、细胞内物

质，以保持组织和细胞固有形态和结构。对免疫组化而言更重要是保存组织、细胞内的抗原，

防止抗原破坏和弥散。需高度重视的是手术或穿刺离体组织必须马上放于标本袋固定，固定

后应与病理申请单及时送交病理科。病理医生有责任与手术送检科室进行必要的配合与沟

通，避免手术后的病理标本随意丢放。

由于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，不同抗原其稳定性各不相同，因此，要了解不

同固定剂的特征。常采用甲醛、戊二醛、Bouin、B5等固定液。由于中性缓冲福尔马林渗透

力强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，提高免疫组织化学检测的阳性率，因此

推荐作为病理标本的首选固定液。应避免使用含重金属的固定剂。

10%中性缓冲福尔马林配制方法：

40%甲醛100ml

磷酸二氢钠4g

磷酸氢二钠6.5g

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蒸馏水900ml

固定液的量一般为组织块总体积的5-10倍，小标本固定时间为4-6小时，大标本为18-24

小时。固定时间不宜超过24小时，以防止组织经甲醛过度固定造成的组织抗原损失和抗原

活性降低。

（2）取材：组织标本的取材厚度一般为0.3cm(不应0.5cm)，面积一般为（1.0-1.5）cmx

(1.0-1.5)cm。

（3）脱水：组织在脱水机中的处理需十分恰当，大量的实验室经验公认加热抗原修复过程

中组织脱片的主要原因是取材过厚以及脱水浸蜡处理不当所致。

（4）包埋与切片：组织经过脱水、透明及浸蜡后，进行石蜡包埋。包埋的石蜡过热或温度

过高容易导致组织抗原的破坏，尤其对于固定不佳的组织，需选用低熔点的石蜡（熔点

60°C）。

（5）切片与展片：切片也是免疫组化染色的重要环节，一般厚度在3-5um之间，淋巴结/

淋巴组织和肾穿组织切片应该更薄些。切片要求完整，厚薄均匀，无皱褶无刀痕，太厚会影

响免疫组化染色结果和判断，还容易在染色过程中发生脱片。展片可采用二次展片，所谓二

次展片：是指在展片过程中，先将组织切片漂浮在30%-40%的酒精溶液中，进行第一次展

片，然后将切片捞起放入45-50°C的温水中进行第二次展片。此方法的优点是酒精溶液于水

之间有一个张力差，这样处理可得到平整无皱褶的组织切片，但像脂肪之类细胞间粘附性较

小的组织接触酒精后会散开，不建议采用此法。

（6）烤片：推荐58-60°C恒温箱烤片2-3小时，但不能进行高温烤片，因为在干燥的条件

下加热切片可以