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体外化学法皮肤变态反应动力学直接多肽反应试验

InChemicoSkinSensitisation:KineticDirectPeptideReactivityAssay（kDPRA）

1范围

本方法规定了动力学直接多肽反应试验的基本原则要求和方法。

本方法用于化妆品用原料的安全性毒理学检测，适用于单一成分物质、已知成分及含量的多成分物质和混合物的潜在皮肤致敏性评价。

2试验目的

预测和评价化妆品用化学原料是否具有潜在的皮肤致敏性。

3定义

3.1多肽消耗百分比PercentPeptideDepletion

与溶剂对照相比，受试物消耗多肽的程度。

3.2单一成分物质Mono-constituentsubstance

一种主要成分含量至少为80%（w/w）的物质。

3.3多成分物质Multi-constituentsubstance

含有两种或两种以上的主要成分，每种主要成分的含量≥10%（w/w）和80%（w/w）的物质。多成分物质是制造过程产生的。

3.4混合物Mixture

由两种或两种以上不发生化学反应的物质组成的固体或液体物质。

4试验原理

试验基本原理同直接多肽试验（DPRA），有致敏性的受试物与多肽模拟的皮肤蛋白（本试验仅使用半胱氨酸多肽）共同孵育，导致多肽量减少。不同于DPRA仅测试化学物质一个浓度和一个时间点，kDPRA以时间和浓度依赖的方式量化评价被测物质的多肽结合反应性。被测物质采用5个浓度与半胱氨酸多肽溶液孵育不同时间（6个时间点）后，通过添加单溴二胺（Monobromobimane,mBrB，CAS74235-78-2）与未结合的半胱氨酸多肽形成荧光复合物，来测量多肽的剩余量。如某时间点未结合多肽百分比的自然对数与受试物浓度呈线性关系（准一级反应），则通过斜率绝对值求得反应速率常数k，换算成对应时间点的反应动力学常数kt（单位：M-1s-1），并计算各时间点lgkt，以其中最大值lgkmax进行结果判断评价受试物的皮肤致敏性。

5试剂和受试物制备

5.1多肽片段与纯度

半胱氨酸多肽：Ac-RFAACAA-COOH，分子量：751.35，纯度：≥95%。

5.2阳性对照物

阳性对照采用肉桂醛（CAS104-55-2；纯度≥95%）。

5.3受试物

5.3.1溶剂的选择

溶剂首选乙腈，其次是pH7.5的磷酸盐缓冲液。二甲基亚砜可能导致肽二聚化，应避免使用。

5.3.2受试物溶液的配制

进行试验前，应评估受试物的溶解度。溶解性可用肉眼鉴别，应形成澄清透明的溶液。一般受试物最大配制浓度为20mM（应完全溶解），对应反应体系终浓度为5mM。试验时用溶剂连续稀释以获得20、10、5、2.5和1.25mM系列浓度的受试物溶液。

20mM的受试物溶液应于试验当日配制，如提前配制，应验证其稳定性。通常配制量为5mL，受试物（阳性对照）理论称取量为分子量×10mg（以纯物质计）。

kDPRA在技术上适用于成分和含量明确的多成分物质和混合物的测试，此时，可以根据不同组分（不包括水）的占比和分子量计算受试物总的纯度和单一的表观分子量，用于计算制备20mM溶液的取样量。

5.3.3阳性对照溶液的配制

按受试物溶液的配制方法，用乙腈溶解阳性对照物制成20mM浓度的溶液，并稀释得到20、10、5、2.5和1.25mM系列浓度的溶液。

5.4多肽贮备液的配制

称取适量半胱氨酸多肽，用pH7.5的磷酸盐缓冲液配制成0.667mM（0.501mg/mL）的溶液。孵育前新鲜配制，配制时使用涡旋仪震荡溶解，必要时可用超声溶解，应在冰浴中进行，防止多肽降解。

pH7.5磷酸盐缓冲液：取0.1mol/L磷酸二氢钠溶液18mL加0.1mol/L磷酸氢二钠溶液82mL混合，测定pH值，应在7.50±0.05之间。若偏酸性，加入0.1mol/L磷酸氢二钠溶液进行调节。若偏碱性，加入0.1mol/L磷酸二氢钠溶液进行调节，4℃保存，可在4周内使用。

5.5单溴二胺溶液的配制

称取8.1mg单溴二胺置于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制成3mM单溴二胺溶液。现用现配，避光保存。

6试验步骤

6.1试验设计

试验设置受试物组（终浓度为0.31mM、0.63mM、1.25mM、2.5mM、5mM）、阳性对照组（positivecontrol,PC）、受试物对照组（testchemicalcontrol,SC）、溶剂对照组（vehiclecontrol,VC）和空白对照组（blankcontrol,BC），其中受试物组每个浓度3个重复，VC组、BC组12个重复，PC和SC每个浓度一个孔。以3个受试物