DB50T 1298-2022 奇异变形杆菌和普通变形杆菌双重Real-Time PCR检测方法　　.docxVIP

ICS65.020

CCSB41DB50

重庆市地方标准DB50/T1298—2022

奇异变形杆菌和普通变形杆菌双重Real-TimePCR检测方法

2022-09-30发布2022-12-30实施

重庆市市场监督管理局发布

I

DB50/T1298—2022

目次

前言 Ⅱ

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4缩略语 1

5检测原理 1

6仪器设备 1

7试剂材料 2

8方法步骤 2

8.1样品采集 2

8.2运输与保存 2

8.3细菌分离 2

8.4检测 3

9结果判定 3

10生物安全要求 3

附录A（规范性)试剂的配制 4

II

DB50/T1298—2022

前言

本文件按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由重庆市农业农村委员会提出、归口并组织实施。

本文件起草单位：重庆市畜牧科学院。

本文件主要起草人：杨睿、蒋雨、付利芝、王孝友、李成洪、覃志初、许国洋、付文贵、陈朝洪、冯刚。

1

DB50/T1298—2022

奇异变形杆菌和普通变形杆菌双重Real-TimePCR检测方法

1范围

本文件规定了奇异变形杆菌和普通变形杆菌的双重Real-TimePCR检测方法的检测原理、仪器设备、试剂材料、方法步骤、结果判定和生物安全要求。

本文件适用于奇异变形杆菌和普通变形杆菌的鉴别检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求。

GB/T6682分析实验用水规格和实验方法。

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

GN增菌液：革兰阴性菌增菌液（GramNegativeBacteriaBroth）

SS培养基：沙门志贺菌属琼脂培养基（SalmonellaShigellaagar）

Real-TimePCR：实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-TimePolymeraseChainReaction）

5检测原理

采用Real-TimePCR技术对奇异变形杆菌（Proteusmirabilis）的UreR基因和普通变形杆菌（Proteusvulgaris）的blaB基因进行检测，能有效地鉴别检测奇异变形杆菌与普通变形杆菌。

UreR基因是奇异变形杆菌的尿素酶调节基因，而在普通变形杆菌中没有；blaB基因是普通变形杆菌的β-内酰胺酶调节基因，但在奇异变形杆菌中不存在。针对奇异变形杆菌的UreR基因和普通变形杆菌的blaB基因，分别设计了特异性引物和探针，通过Real-TimePCR技术在FAM通道和HEX通道分别检测奇异变形杆菌和普通变形杆菌。

6仪器设备

6.1荧光定量PCR仪：同时有FAM和HEX通道。6.2分析天平：精度为±0.1g。

6.3高速冷冻离心机。6.4恒温培养箱。

6.5振荡培养箱。6.6超净工作台。

6.7微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、1000μL）及配套带滤芯吸头。6.8－80℃低温冰箱和常规医用冰箱。

6.9超纯水仪。

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DB50/T1298—2022

6.10恒温水浴锅。

6.11组织研磨仪。

6.12二级生物安全柜。

7试剂材料

本文件所使用的水应符合GB/T6682中规定的二级水要求。7.1GN增菌液应按附录A中A.1的要求配制。

7.2SS培养基应按附录A中A.2的要求配制。7.3营养肉汤应按附录A中A.3的要求配制。7.4商品化的细菌基因组提取试剂盒。

7.5商品化的荧光定量2TaqPCRMaster