细胞迁移和侵袭实验技术.ppt

注意事项1.膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生；2.放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。3.枪垂直，枪尖伸入孔中下大概4/5处，迅速加样，不要迟疑，打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液面。4.洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。第22页，共35页，星期日，2025年，2月5日第23页，共35页，星期日，2025年，2月5日第24页，共35页，星期日，2025年，2月5日第25页，共35页，星期日，2025年，2月5日第1页，共35页，星期日，2025年，2月5日体内实验：皮下移植瘤模型原位移植瘤模型肿瘤细胞运动体外实验第2页，共35页，星期日，2025年，2月5日肿瘤细胞运动常用研究方法Textinhere侵袭实验趋化运动划痕实验第3页，共35页，星期日，2025年，2月5日实验原理细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。划痕实验（伤口愈合实验，ScratchAssay）第4页，共35页，星期日，2025年，2月5日操作步骤1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。第5页，共35页，星期日，2025年，2月5日操作步骤2.在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%；3.用10mltip枪头用力均匀地在培养皿中划痕，PBS洗涤2次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。??第6页，共35页，星期日，2025年，2月5日操作步骤4．放入37℃?5%?CO2培养箱培养。每3h测量一次细胞运动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定)。第7页，共35页，星期日，2025年，2月5日操作步骤5.数据处理：每个时间点的距离长度-0时距离=每个时间长度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴，迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始0时与实验结束时实验组与对照组的照片。第8页，共35页，星期日，2025年，2月5日注意事项

?1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（2%）否则细胞增殖就不能忽略。?3.按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。4.实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。?第9页，共35页，星期日，2025年，2月5日第10页，共35页，星期日，2025年，2月5日第11页，共35页，星期日，2025年，2月5日第12页，共35页，星期日，2025年，2月5日第13页，共35页，星期日，2025年，2月5日实验原理趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生存、生命的繁衍等具有重要的意义。趋化运动实验（ChemotaxisAssay）第14页，共35页，星期日，2025年，2月5日微孔小室中的趋化实验微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。第15页，共35页，星期日，2025年，2月5日第16页，共35页，星期日，2025年，2月5日BoydenChamber装置第17页，共35页，星期日，2025年，2月5日第18页，共35页，星期日，2025年，2月5日实验步骤1.在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的趋化因子置于趋化小室的下室，30ml/孔，每个浓度加3个孔，其中只加BM的孔为阴性对照；2.取对数生长期细胞，0.1%BM重悬细胞，调整细胞浓度为5×105/ml；3.加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上拧紧;在上室中加入细胞，50ml/孔，每个浓度加3