DB22T 2079-2014 皮革中动物源性成分检测 实时荧光PCR 法.pdfVIP

ICS59.140.20

B45

备案号：42285-2014DB22

吉林省地方标准

DB22/T2079—2014

皮革中动物源性成分检测实时荧光PCR法

Detectionofanimal-derivedingredientsinleatherbyrealtimePCRmethod

2014-05-04发布2014-06-01实施

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T2079—2014

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国延边出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：刘金华，聂丹丹，刘韬，王玮琳，刘阳，吴连鹏，王宁，罗雁菲。

I

DB22/T2079—2014

皮革中动物源性成分检测实时荧光PCR法

1范围

本标准规定了天然皮革中动物源性成分的定性检测方法。

本标准适用于天然皮革牛、羊、猪成分的定性PCR检测，不适用于再生革、人造革和合成革。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

利用实时荧光PCR技术，根据不同物种的特异性基因序列对牛、羊、猪源性成分进行鉴定。利用CTAB

裂解液破碎细胞，酚、三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行实时荧光PCR

检测；通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增

反应中每一个循环产物荧光信号的扩增曲线判定，实现对皮革中牛、羊、猪源性成分的定性分析。

4试剂和材料

除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB／T6682中二级水的要求。

4.1十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)。

4.2三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris]。

4.3三氯甲烷(chloroform)。

4.4无水乙醇(absoluteethanol)。

4.5异丙醇(isopropylalcohol)。

4.675%乙醇溶液：取750mL无水乙醇，加水定容至1L。

4.7乙二胺四乙酸钠盐（Na2EDTA）。

4.8苯酚/三氯甲烷/异戊醇(25:24:1,体积比）。

4.92XReal-timePCR预混液。

4.10Tris-HCl：在800mL去离子水中溶解121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入60mL浓盐酸，

冷却至室温后调节pH值至7.5，加水定容至1L，分装后121℃高压灭菌20min。

4.111.2mol/L氯化钠溶液

4.12CTAB裂解液：2%CTAB，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.02mmol/LNa2-EDTA

(pH8.0)。

4.13TE缓冲液：配制每升TE缓冲液，应在800mL水中依次加入1mol/LTris-HCl(pH8.0)10

mL,O.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL，加水定容至1L，分装后121℃高压灭菌