DB21T 3054-2018 犬巴贝斯虫荧光定量PCR检测方法　.docxVIP

ICS11.220B41

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T3054—2018

犬巴贝斯虫荧光定量PCR检测方法

DetectionoffluorescentquantitationPCRforBabesiacanis

2018-10-30发布2018-11-30实施

辽宁省市场监督管理局发布

DB21/T3054—2018

I

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3缩略语 1

4原理 1

5仪器和器材 1

6试剂和引物 2

7样品的采集和前处理 2

8操作步骤 2

9检测过程中防止交叉污染的措施 3

10废弃物处理 4

DB21/T3054—2018

II

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。

本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。

本标准主要起草人：高志峰、张才、杨国丽、邓文超、张健、马建山、高原、兰德松。

DB21/T3054—2018

1

犬巴贝斯虫荧光定量PCR检测方法

1范围

本标准规定了犬巴贝斯虫的荧光定量PCR检测方法的技术要求，包含规范性引用文件、缩略语、原理、仪器和器材、试剂和引物、样品的采集和前处理、操作步骤、检测过程中防治交叉污染的措施、废弃物处理等。

本标准适用于在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行全血液样品中犬巴贝斯虫核酸的检测，适用于犬巴贝斯虫病的确诊及流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

中华人民共和国农业部公告2003年第302号《兽医实验室生物安全技术管理规范》

中华人民共和国农业部公告2017年第25号《病死及病害动物无害化处理技术规范》

3缩略语

该部分对本技术规范中用到的缩略语进行了注解：DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）bp：碱基对（basepair）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）Taq酶：ExTaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Trisacetate-EDTAbuffer）

4原理

巴贝斯虫病是指由巴贝斯科的原虫所引起的一种梨形虫病，主要以侵害家畜的红细胞为特征的血液原虫病。犬巴贝斯虫病是一种经硬蜱传播的血液原虫病，临床上以严重贫血、高热、黄疸、呼吸困难为特征。根据犬巴贝斯虫（Babesiacains,B.canis）裂殖子基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。

5仪器和器材

DB21/T3054—2018

2

5.1低温高速离心机（最大离心力12000rpm）.

5.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱，-70℃±1℃冰箱。

5.3生物安全柜。

5.4荧光PCR扩增仪。

5.5分析天平。

5.6离心管：1.5ml离心管和0.2mlPCR专用离心管。

5.7微量可调移液器：1000μl，200μl，100μl，50μl，20μl，10μl，2μl。

6试剂和引物

注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含RNA或RNase的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。

6.15mMol/L的Tris/HCl(pH7.5～8.0)

6.2灭菌双蒸水6.370%乙醇

6.4犬巴贝斯虫阳性对照组基因

6.5特异性引物：

正向引物：5’-TGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTG-3’反向引物：5’-TCCATGCTGAAGTATTCAAGACACA-3’。

6.6基因组DNA纯化试剂盒1