DB21T 3120-2019 水产动物物种分子鉴定COI、16S rRNA分子标记法.docxVIP

ICS65.150B51

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T3120—2019

水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法

TechnicalspecificationforspeciesmolecularidentificationusingCOIand16SrRNAofaquaticanimals

2019-02-28发布2019-03-28实施

辽宁省市场监督管理局发布

DB21/T3120—2019

I

前言

本标准依据GB/T1.1—2009给出的规则制定。本标准由大连市质量技术监督局提出。

本标准由辽宁省农业农村厅归口。

本标准主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。

本标准主要起草人：高磊、赫崇波、鲍相渤、高祥刚。附录A、B、C为资料性附录。

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水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法

1范围

本方法规定了水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法的相关术语和定义，标记方式，试剂、仪器和设备，样品采集、保存和前处理，DNA提取和检测，序列扩增和测序，以及物种鉴定的方法。

本方法适用于水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

水产动物物种分子鉴定aquaticspeciesmolecularidentification

指利用分子生物学手段,对水产动物样本（尤其适用于形态学特征相近、模糊或丢失的样本）的分子标记进行分析，鉴定生物种类的过程。

3.2

聚合酶链式反应polymerasechainreaction（PCR）

用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异DNA片段的过程。

3.3

DNA序列测定DNAsequencing测定DNA分子的核苷酸序列。

3.4

序列比对alignment

为确定两个或多个序列之间的相似性和同源性，将他们按照一定的规律进行排列。3.5

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2

DNA条形码-COI

细胞色素c氧化酶亚基I（cytochromeccoxidasesubunitI）。3.6

16SrRNA

16S核糖体核糖核酸（16SribosomalRNA）。

4标记方式

水产动物的COI和16SrRNA的DNA序列进化速度较快，同时又相对保守，可作为分子标记条形码用于物种鉴定。通过PCR技术扩增水产动物的COI和16SrRNA基因部分序列，测序后在已知数据库中进行序列比对，确定物种分类信息。本方法同时对COI和16SrRNA两种分子标记条形码进行分析，并在GenBank（/genbank）和BOLDSystem（）两个数据库中比对，确保鉴定成功率和准确率。

5试剂、仪器和设备

5.1试剂

实验仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T6682一级水要求。主要包含以下内容：

——无水乙醇；——95%乙醇；

——TE缓冲液（pH7.6）（100mol/LTris-Cl，pH7.6；10mmol/LEDTA，pH8.0）；

——Taq酶（5U/μL）；——超纯水；

——10×PCR缓冲液（500mmol/LKCl；100mmol/LTris-Cl，pH8.3；15mmol/LMgCl2）；——引物（10μmol/L）；

——dNTP混合液（每种脱氧核糖核苷三磷酸浓度2.5mmol/L）；——溴化乙锭（10mg/mL）；

——琼脂糖；

——电泳标记物（markers）；——平衡酚；

——氯仿/异戊醇（24:1）；

——10×Tris硼酸（10×TBE）电泳缓冲液；

——灭菌蒸馏水；——液氮；

——细胞裂解液（20mmol/L）。

5.2仪器和设备

实验用仪器和设备主要包含以下内容：

——凝胶成像分析系统；——PCR仪；

——低温高速离心机（4℃,12000转）；

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——稳压稳流电泳仪；——单道可调移液器；

——电子天平（0.001g）；——水