DB21T 3074-2018 花生抗网斑病鉴定技术规程　　.docxVIP

ICS65.020.01B15

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T3074—2018

花生抗网斑病鉴定技术规程

Ruleforevaluationofresistancetowebblotchinpeanut

2018-12-25发布2019-01-25实施

辽宁省市场监督管理局发布

DB21/T3074—2018

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前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省农村经济委员会提出并归口。本标准由辽宁省农业科学院负责起草。

本标准主要起草人：臧超群、林英、谢瑾卉、于舒怡、梁春浩、刘晓舟、安福涛、张海东、金桂华。

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花生抗网斑病鉴定技术规程

1范围

本标准规定了花生抗网斑病（PhomaarachidicolaMarasasPauerBoerema）鉴定技术的病原物分离、接种体制备、室内抗性鉴定、田间抗性鉴定、病情调查、抗性评价、鉴定记载方法等。

本标准适用于花生（ArachishypogaeaL.）品种及种质资源对花生网斑病抗性的室内、田间鉴定及评价。

2规范性引用文件

下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T2391农作物品种区域试验与鉴定规程花生GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3试剂、材料与仪器设备

本标准所用试剂在未加说明时均采用分析纯试剂。实验室用水应符合GB/T6682中规定的三级水要求。

3.1PDA培养基

称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加入1000mL水，煮沸20min—30min，纱布过滤，补水至1000mL，再加入18g琼脂和18g葡萄糖，搅拌均匀，高压灭菌（121℃,20min）。

3.2OA培养基

称取燕麦粉15g，加入水1000mL，煮沸30min，加入琼脂10g，pH自然，高压灭菌（121℃,20min）。

3.3恒温培养箱：（28+2）℃。

3.4显微镜：物镜头10倍-100倍。

3.5电子天平：感量0.01g。

3.6超净工作台。

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3.7高压灭菌器。

3.8冷藏箱（-4℃)。

3.9低温冰箱：最低温度-40℃

4病原物分离与接种体制备

4.1病原物分离

从具有典型症状的花生叶片病斑处挑取花生网斑病菌分生孢子器置于无菌水中震荡3min，将分生孢子悬浮液涂布于水琼脂平板上，用接种针挑取单孢置于马铃薯葡萄糖（PDA）培养基上，26℃培养箱中暗培养，经观察菌落和孢子形态结合ITS序列比对，鉴定为花生茎点霉菌(P.arachidicolaMarasas.PauerBoerema)，致病性测定后确定为供接种用菌株。于4℃条件下保存，或20%甘油中-40℃条件下长期保存，备用。

4.2接种体制备

接种前15d~30d，将病菌接种于马铃薯葡萄糖（PDA）培养基平板上25℃恒温培养5d，利用5mm打孔器从菌落边缘制取菌饼，置于燕麦琼脂（OA）培养基平板上25℃、近紫外灯照射（波长340~380nm，8W×3）培养10d~20d。用无菌解剖刀于超净工作台中刮取病菌的分生孢子器，置于装有少量无菌水的50mL无菌烧杯中，静置20min，使分生孢子器吸水胀破，释放分生孢子，配制成浓度为1×105个/mL孢子悬浮液（如未立即接种使用，可置4℃条件下保存，保存时间3d以内）。接种前每毫升孢子悬浮液中加入Tween201μL以增加病菌孢子与叶片的粘附性，加入0.05mg蔗糖提高孢子萌发率。

5室内抗性鉴定

5.1室内离体叶片准备

在长宽高为10cm×10cm×8cm的花盆中播种籽粒饱满的花生种子3粒，定期浇水，于每天26℃、12h光暗交替的培养箱中培养至下针期。剪取底部向上的第3、4片复叶，用脱脂棉包裹叶柄插入经人工打孔后的接种杯（直径4cm，高4.8cm）中，杯内放入30mL清水。

5.2接种

用8号水粉笔沾取孢子悬浮液均匀涂抹于离体叶片，直至整片复叶涂满孢子悬浮液，用6号自封袋（120mm×170mm）保湿。

5.3接种后管理

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将接种后的离体叶片放置于每天26℃、12h光暗交替的植物培养箱中培养。

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