植物组织培养的基本方法.pptVIP

植物组织培养的基本方法目的要求一般掌握灭菌和消毒的区别掌握灭菌的方法和具体操作过程掌握无菌接种的步骤掌握外植体的选择、培养方法和步骤一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法掌握试管苗驯化的基本程序一般掌握快速繁殖试管苗的计划安排及增殖倍数计算方法灭菌灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。而通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台、等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行操作，就叫做无菌操作。常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类。物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。1．培养基用湿热灭菌培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序按容器大小不同，保压时间有所不同（下表）。容器的体积（ml）在121℃灭菌所需最少时间（min）２０～５０１５７５～１５０２０２５０～５００２５１０００３０用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌干热灭菌是利用烘箱加热到160～180℃的温度来杀死微生物。通常采用170℃持续90分钟来灭菌。不耐热的物质采用过滤灭菌一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法-防细菌滤膜。空间采用紫外线和熏蒸灭菌紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200～300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射物以不超过1.2米为宜。熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。升汞与高锰酸钾，常用熏蒸剂是甲醛。一些物体表面用药剂喷雾灭菌物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表面、植物材料表面等。可用70％的酒精反复涂擦灭菌，１％～２％的来苏儿溶液以及0.25～１％的新洁尔灭也可以。01植物材料表面用消毒剂灭菌添加标题02外植体的选择:添加标题03外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应不一样；添加标题04取材季节：大多数植物应该在生长开始的时候采集；添加标题05器官的生理状态和发育年龄：幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力；添加标题06外植体大小：茎尖培养中，外植体越小成活率越低。添加标题外植体的灭菌方法:植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。第二步是对材料的表面浸润灭菌。第三步是用灭菌剂处理。最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3分钟左右，视采用的消毒液种类，涮洗3～10次左右。常用的消毒剂：既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或分解掉；应当正确选择消毒液的浓度和处理时间，应尽量减少组织的死亡；一些表面消毒剂的消毒效果不相同。灭菌剂使用浓度持续时间(min)去除的难易效果次氯酸钙90-100g/l5～30易很好次氯酸钠5-20g/l5～30易很好漂白粉饱和溶液5～30易很好氯化汞0.1-10g/l2-10较难最好乙醇700-750ml/l0.2-2易好过氧化氢100-120ml/l5-15最易好溴水10-20ml/l2-10易很好抗菌素4～50mg/L30～60中较好接