猪圆环病毒2型和3型荧光PCR检测方法.docx

猪圆环病毒2型和3型荧光PCR检测方法

2

SN/T5671-2024

Ct循环阅值(cyclethreshold)

DNA脱氧核糖核酸(dcoxyribonuclcieacid)

dPCR数字PCR(digitalPCR)

EPC外源过程质控(externalprocesscontrob)

F-PCR荧光PCRCluorescentPCR)

NC阴性对照(negativecontrol)

PC阳性对照(positivecontrol)

PCR聚合酶链式反应(polymerasechainrenction)

PCV2猪圆环病毒2型(porcinecireovirus2)

PCV3猪圆环病毒3型(porcinecircovirus3)

qPCR实时荧光PCR(real-timePCR)

4仪器和设备

4.1Ⅱ级生物安全柜。

4.2实时荧光PCR扩增仪。

4.3高速台式冷冻离心机(角转子：24×1.5mL,12×15mL;13.0007/min)。

4.4微量核酸蛋白测定仪。

4.5微量移液器(0.5μL~10pL,2μL~20pL,20gL~200pL100μL~1000pL)。

4.6组织匀浆仪。

4.7高压灭菌器。

4.8数字PCR系统：包括微反应体系发生器和微反应体系荧光检测仪。

5试剂和材料

5.1水：符合GB/T6682规定的一级水。

5.2灭菌生理盐水：配制应符合A.1的要求。

5.33mol/L.NaOAe溶液：配制应符合A.2的要求。

5.4磷酸盐缓冲液(PBS:配制应符合A.3的要求。

5.5无核酸酶水：配制应符合A.4的要求。

5.6DNA提取试剂：CTAB裂解液、蛋白酶下溶液(20mg/mL)、Tris饱和酚、三氯甲烷、异丙醉、无水乙醇。

5.72×PCR预混反应液(probeqPCR)。

5.8质控物质：阳性质控品用符合要求或具备一定资格单位提供的含PCV2和PCV3DNA的组织样品或质粒(序列参考信息见附录B中B.2~B.5);阴性质控品为不含PCV2和PCV?的组织或血液。

5.9荧光PCR扩增管或反应板、数字PCR微反应体系生成联排管及覆膜或芯片

5.10无核酸酶离心管。

5.11数字PCR反应预混液。

5.12引物和探针：引物探针序列见表1,扩增序列的信息见附录B.

SN/T5671—2024

表1引物探针序列信息

方法

病毒

引物名称

序列

扩增片段长度

实时荧光PCR

PCV2

PCV2-gF(上游引物)PCV2-qF2C上游引物)

GARACTAAAGGTGGAACTGTACCCGGGCTGGCTGAACTTTTG

118bp

87bp

PCV2-qRC下游引物)PCV2-qR2(下游引物)

TCCGATARAGAGCTTCTACAGCCCAGGTGGOCCACAAT

PCV2-qP(探针)PCV2-qP2(探针)

HEX-AGGAGTACCATTCCAACGGGG-BHQ1HEX-TCACGCTTCTGCATTTTCCCGC-BHQ1

PCV3

PCV3-qFC上游引物)PCV-qF2(上游引物)

GGTGAAGTAACGGCTGTGTTTTTATAATGGGGAGGGTGCTGT

86bp

76bp

PCV3-qRC下游引物)PCV3-qR2(下游引物)

ACACTTGGCTCCARGACGACcCCCAATTCTCAGCAATTCA

PCV3-qP(探针)PCV3-qP2(探针)

FAM-ATGCGGAAAGTTCCACTCCK-BQ1

FAM-TGATTTTTATGGGTGGGTTCCATTT-BHQ

内参基因DC

ICqF(上游引物)

TGATGTTACCACAAA16TT