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无菌操作技术原理及实验

无菌操作技术定义：指在实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。保证培养物不被环境中微生物污染；防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。目的：微生物无菌操作技术；细胞无菌培养。范围：AB无菌技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。A接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程。B原理：微生物无菌操作技术及接种技术1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀无菌操作材料：接种工具无菌器材准备：灭菌器材：枪头、玻璃器皿、培养基、无菌衣等进行高压灭菌处理。培养基的制备：目的菌：大肠杆菌LB培养基：（蛋白胨易吸湿，应迅速称取；称取一种药品后，药匙洗净擦干后再称另一种药品。）；（勿调过头，以免回调而影响各离子浓度。）分装要求：（分装时，不要使培养基沾在瓶口，以免玷污瓶塞而引起污染。）液体：试管：试管高度的1/4；三角瓶：不超过容积的1/2；固体：试管：不超过1/5，灭菌后制成斜面；平皿：15ml。灭菌条件：121℃，20min。（温度时间不宜过高过长，以免破坏营养物质）抗生素的加入：放至50℃，握紧3s不烫手。无菌检查：将灭菌培养基放入37℃的培养24-48h后观察。灭菌方式：辐射灭菌：60Co-γ射线，医疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品等。干热灭菌法：利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。160~170℃*120min以上、170~180℃*60min以上或250℃*45min。适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌的物品灭菌，如玻璃器具、金属材质容器、纤维制品、固体试药、液状石蜡等均可采用本法灭菌。湿热灭菌法：热力灭菌中最有效、应用最广泛。121℃、30min。药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可采用本法灭菌。气体灭菌法：环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛、臭氧（O3）等。过滤除菌法：除菌滤膜分亲水和疏水，孔径一般不超过0.22um。过滤器不得对被滤过成分有吸附作用，也不能释放物质，不得有纤维脱落。紫外线灭菌：UVC200-300nm，254-257nm灭菌能力最强。原理：诱导胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制；产生臭氧共同杀菌。

高压带有液体的瓶子时要旋松瓶盖，防止瓶内压力过大使瓶子碎裂；1包有报纸的物品，立即进行干燥处理。2仪器检查：仪器摆放在水平地面上，周围有空隙。3加水：水位至平台处，不要过多。使用去离子水。4摆放：相互间有适当缝隙，有利于蒸汽的穿透，提高灭菌效果。5密封：顺时针旋转，直到不到旋转为止。6加热：打开开关，检查温度和时间。7排气：打开放气阀价格你干冷空气排出。8灭菌：干冷空气排出后，拧紧阀门。9结束：关闭开关，压力降至0打开放气阀排尽余气后方可打开高压锅。10注意：高压灭菌锅操作步骤及注意事项：1选用合适溶剂溶解后，0.22um过滤除菌。2氨苄青霉素：-20℃长期保存，4℃保存一个月，37℃保存2-3天。3卡那霉素、四环素、链霉素：-20℃长期保存，4℃、37℃比氨苄保存时间稍长，四环素避光保存。抗生素的配制及保存：无菌环境的要求与保持：无菌环境无菌室超净工作台（原理：在特定的空间内，洁净空气（过滤空气）按设定的方向流动而形成的。）使用前打开紫外灯照射40~60分钟开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面。使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物；使用完毕，关闭煤气开关或酒精灯；使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照射15分钟.定期将初效过滤器拆下清洗，清洗周期一般为3-6个月；高效空气过滤器的使用期限为十八个月。定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。超净台的使用与维护在操作中不应有大幅度或快速的动作；1使用玻璃器皿应轻取轻放。2在火焰上方操作，水平距离5cm范围内为无菌区域。3接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；4在接种培养物时，动作应轻、准。5不能用嘴直接吸吹吸管。6带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。7酒精灯