正常细胞的培养技术mia.pptVIP

实验室也经常使用幼地鼠肾细胞、鼠胚及地鼠胚成纤维细胞、鸡胚纤维母细胞等，这些细胞的分离培养与人细胞的分离培养基本方法是一样的。0102骨骼肌、心肌和平滑肌细胞都可在体外培养中生长，心肌细胞在培养的最初几天还具有自动节律性收缩功能，传代培养时可能会逐渐丧失这种功能。平滑肌细胞可通过胰蛋白酶或胶原酶消化法从血管气管壁及肠壁中获得。骨骼肌可从四肢中获得。肌细胞含有数种抗原标记物，如肌浆球蛋白、原肌凝蛋白等。肌动蛋白等可在大多数细胞中发现，但并非细胞的特有标记物，肌细胞分化时肌酸磷酸酶活性升高。肌肉组织细胞骨骼肌细胞分离培养动物胚或幼体四肢，特别是大腿肌组织为最好的培养材料，取材常用生后1~2天的乳鼠（Wistar大鼠更好）。人骨骼肌细胞来源最好是人工流产的孕期为3~5个月的健康胎儿肢体。无菌取肌组织，洗涤、剪切、消化。常规培养，注意观察细胞形态、数量的变化，及时换液、传代。肌肉细胞成片后，可用胰蛋白酶消化分散，进行传代培养，可传10~20代。心肌细胞培养心肌组织是最早利用的培养材料之一，最常用的是孵育10～12天的鸡胚心肌，新生大鼠、乳鼠及人胎儿心肌等。心肌是比较容易培养和生长的组织，可应用多种方法进行培养，如悬滴培养、组织块培养和消化培养法等。主要是取心室肌培养，消化分离方法与前相同。各种骨细胞分离培养包括软骨细胞分离培养、成骨细胞分离培养和破骨细胞分离培养等。软骨分为生长部和休止部，其中生长部软骨细胞在体外培养条件下代谢较活跃，具有形成软骨基质的功能和成骨细胞的某些特性。软骨细胞埋藏于致密的糖蛋白软骨基质中，必须经过一系列酶消化,才能获得少量细胞，在呈弱碱性并增加Mg++浓度的培养液中易于生长。软骨细胞分离培养操作要点是：切碎软骨组织，用透明质酸酶、胰蛋白酶和胶原酶消化两遍以除去基质，再用胶原酶长时间消化，收集细胞，按常规贴壁单层细胞培养法，培养于弱碱性的F12培养液中。体外培养的软骨细胞，很像上皮样细胞，可形成具有折光性的细胞外基质，经甲苯胺兰染色呈异染性。细胞组织化学染色：软骨细胞可以特异性合成葡萄糖胺聚糖(GAG),Ⅱ型和Ⅹ型胶原，并具有碱性磷酸酶活性(免疫组化阳性)，也可用定量法测出其含量。010203成骨细胞分离培养骨细胞是一种终末化的细胞，埋藏于骨基质中，从皮质骨中分离培养骨细胞至今未见报导，只是在胎鼠或鸡胚颅骨细胞培养时见到少量星状细胞，呈花边样网状结构。在某些激素(如甲状旁腺素)的作用下或无血清培养中，这些细胞可变为圆形，二羟基维生素D3可以刺激某些成骨样细胞变为星状。骨细胞可以和成骨细胞一起从胎鼠或鸡胚颅盖骨上分离出来，也可由体外培养的成骨细胞分化而来，OB7.3阳性的细胞刚分离时为圆形，贴壁生长变为星形，具有胞浆突起，数日后胞突连成网状，使星形细胞相互连接，不依赖于细胞外基质。成骨细胞包绕在硬组织中，致使处理困难，用骨组织块法、酶消化法、骨膜组织法、骨髓培养法以及薄层骨片经EDTA处理，并经胶原酶消化，均可分离培养出成骨细胞，体外培养的成骨细胞保持有骨组织细胞的某些特性。破骨细胞分离培养01破骨细胞的研究表明，脾脏和骨髓中单个核细胞可以互相融合形成多核的破骨细胞，随血流到达破骨细胞活动活跃的部位，在新生动物的长骨内面反复冲洗或用胶原酶消化，新生动物的颅盖骨都可获得破骨细胞，用骨髓培养法也可使单个核细胞分化为破骨细胞。02骨髓细胞的分离培养01骨髓可分为造血干/祖细胞和基质细胞两类，均可在体外进行培养，扩增和开展细胞定向分化的研究。02骨髓基质细胞在骨髓中可为造血干/祖细胞提供微环境，可分泌许多种细胞因子，对造血干/祖细胞的分化起着独特的支持作用。此外，骨髓基质细胞还与成骨效应密切相关，目前认为骨髓基质细胞有内皮细胞、平滑肌细胞、网状细胞、脂肪细胞或骨细胞和破骨细胞等，因此，对开展成骨效应、成骨细胞分化和上述各类细胞的分离、鉴定及其功能的实验研究，已引起科研人员和临床医生的极大兴趣。体外大量扩增骨髓基质细胞应用于临床治疗骨不连及软骨缺损具有广阔的应用前景。新生动物及胚胎骨的骨髓，人和胎儿的骨髓，成人取自术后骨，胎儿取自流产胎儿骨的骨髓或临床上抽骨髓检查时剩余的骨髓或自愿供骨髓者。1、骨髓细胞来源骨髓中的细胞，一类为不能贴壁、在培养基中悬浮生长的造血干/祖细胞、淋巴细胞、红细胞，另一类为能缓慢贴壁生长的骨髓基质细胞，这两类细胞不仅形态上有明显差异，而且分离培养方法、条件以及功能应用性研究也有所不同。2、骨髓细胞的分离培养0102第五章正常细胞的培养技术正常细胞，不论是来自人或动物的细胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难，因为它们是已分化的细胞，对体外生存条件要求严格，目前体外模拟的培养条件都还达