植物学RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展.pptVIP

LOGOLOGOLOGOLOGORNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展InterdactionRNA干涉(RNAinterference,简称RNAi)是指一些小的双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术。可以快速分析靶基因的功能，近年来发展迅速,已成为功能基因组研究和反向遗传学研究的有力工具。RNAi技术被《Science》杂志评为2002年度的十大科技突破。0102RNAi技术概述RNAi引起基因沉默的途径植物RNAi表达载体的构建RNAi技术在植物上的应用RNAi存在问题与展望Text1Text2Text3Text4Text5ContentsRNAi技术概述1.1RNAi的发现1.2RNAi的分子机制1.3RNAi作用的特点1.1RNAi的发现1995年,康乃尔大学的Guo和Kempheus利用反义RNA(antisenseRNA)技术特异性地阻断线虫(C.elegans)中的par-1基因的表达以期得到与对照组注射正义RNA(senseRNA)相反的结果，但结果却令他们费解：二者同样阻断了par-1基因的表达途径。11998年,Fire和Mello等首次将正义链和反义链的混合物注入秀丽新小杆线虫,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默(genesilencing)。他们将这种现象称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。21.2RNAi的分子机制外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内,产生一些dsRNA。胞质中的核酸内切酶Dicer将这些dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的短双链RNA(大约21~25bp),即siRNA。siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链,然后反义siRNA再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的功能,在结合部位切割mRNA,被切割后的断裂mRNA随即降解。RNAi信号的放大siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在依赖RNA的RNA聚合酶(RNdependentRNApolymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA完全降解。01这是一种类似于RNA聚合酶的链式反应，该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为模板，在RdRP作用下扩增靶mRNA，产生新的二级siRNAs(单链的具有明显极性的反义RNA)。在Dicer酶的作用下，这些二级siRNAs又能反作用于靶mRNA，使其降解，产生更多的siRNAs。021.3RNAi作用的特点RNAi效应可以稳定的遗传给子代,在子代的表现型呈孟德尔遗传方式。在植物中,RNAi信号可以通过胞间连丝或维管组织在细胞间传递;而在动物中,RNAi信号的扩散需要特殊蛋白参与,在膜上形成跨膜通道而传播到整个机体。研究发现,如果除去或降低内源性ATP含量,dsRNA对靶基因的抑制作用明显降低或消失,加入外源性ATP后,抑制作用仍未加强。说明RNAi是一个对ATP依赖的过程,且外源性ATP对此无促进作用。ATP依赖性高度特异性可传播性可遗传性研究发现RNAi过程中不同浓度的dsRNA产生的效果一样。Miki等研究水稻OsRac基因家族的功能时,通过构建单一基因片段的植物表达载体,成功地抑制了OsRac基因家族的多个基因。说明RNAi可实现在一个个体或一个细胞内同时沉默多个基因。由dsRNA诱导的RNAi只引起与dsRNA同源的mRNA降解,不影响其它基因的表达,具有很高的特异性。siRNA具有特征性的结构:5’末端为磷酸基,3’末端为羟基,并且有2个突出的单链核苷酸。这种结构对RNAi是十分必要的。高效性RNAi技术概述RNAi引起基因沉默的途径植物RNAi表达载体的构建RNAi技术在植物上的应用RNAi存在问题与展望Text1Text2Text3Text4Text5Contents转录后基因沉默（PTGS）转录水平基因沉默（TGS）翻译水平上基因沉默（miRNA）RNAi引起基因沉默的途径转录后基因沉默是最普