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猫杯状病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

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猫杯状病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

摘要：猫杯状病毒（FelineCalicivirus,FCV）是猫科动物常见的病原体之一，其VP1蛋白是病毒颗粒的主要衣壳蛋白，具有高度的免疫原性和病毒保护性。本研究旨在制备针对猫杯状病毒VP1蛋白的单克隆抗体，并通过生物信息学分析和实验验证鉴定其抗原表位。首先，通过原核表达系统表达VP1蛋白，并纯化得到目的蛋白。然后，采用细胞融合技术制备单克隆抗体，并通过间接ELISA和Westernblot验证抗体的特异性。最后，利用生物信息学工具预测VP1蛋白的抗原表位，并通过免疫印迹和细胞免疫荧光实验验证预测结果的正确性。本研究成功制备了针对猫杯状病毒VP1蛋白的单克隆抗体，并鉴定了其抗原表位，为FCV的免疫学研究和疫苗开发提供了重要的理论基础和技术支持。

猫杯状病毒（FelineCalicivirus,FCV）是猫科动物常见的病原体之一，可引起猫的多种疾病，如上呼吸道感染、肺炎和肠道感染等，严重威胁着养猫业的发展。FCV的VP1蛋白是病毒颗粒的主要衣壳蛋白，具有高度的免疫原性和病毒保护性，因此，针对VP1蛋白的抗体在FCV的免疫学研究和疫苗开发中具有重要意义。近年来，单克隆抗体的制备和应用在病毒性疾病的研究和治疗中取得了显著进展。本研究旨在制备针对猫杯状病毒VP1蛋白的单克隆抗体，并通过生物信息学分析和实验验证鉴定其抗原表位，为FCV的免疫学研究和疫苗开发提供新的思路和方法。

一、实验材料与方法

1.1VP1蛋白的表达与纯化

(1)猫杯状病毒VP1蛋白的表达采用大肠杆菌系统进行，首先设计合成编码VP1蛋白的重组质粒，通过PCR技术扩增并纯化目的基因。随后，将重组质粒电转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，通过IPTG诱导蛋白表达。经过优化诱导条件，如IPTG浓度、诱导温度和时间等，以获得高效表达的VP1蛋白。表达后的细胞经过超声波破碎，释放出包含VP1蛋白的胞内溶液。

(2)获得的胞内溶液通过离心去除细胞碎片，上清液经镍亲和层析柱纯化，利用VP1蛋白对镍离子的亲和性，将目标蛋白从混合物中分离出来。纯化过程中，通过调整洗脱缓冲液中的咪唑浓度，进一步纯化目标蛋白，获得高纯度的VP1蛋白。纯化后的蛋白通过SDS电泳分析，验证蛋白的纯度和分子量。

(3)为确保VP1蛋白的活性，对纯化后的蛋白进行复性处理。将纯化后的VP1蛋白溶解在缓冲液中，缓慢降低温度至室温，同时加入还原剂和稳定剂，以促进蛋白的正确折叠。复性后的蛋白再次通过SDS电泳分析，确认蛋白的复性效果。最终获得的复性VP1蛋白用于后续的单克隆抗体制备和抗原表位鉴定实验。

1.2单克隆抗体的制备

(1)单克隆抗体的制备采用细胞融合技术，以小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合。首先，通过免疫小鼠，获取针对猫杯状病毒VP1蛋白的高亲和力抗体。免疫小鼠后，收集脾细胞，并与小鼠骨髓瘤细胞进行融合。融合过程中，使用聚乙二醇（PEG）作为促融剂，提高融合效率。融合后的细胞经过筛选，得到杂交瘤细胞。通过间接ELISA检测杂交瘤细胞分泌的抗体，筛选出能够特异性识别VP1蛋白的杂交瘤细胞。

(2)筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养，以获得单克隆抗体。克隆化培养采用有限稀释法，将杂交瘤细胞稀释至单细胞浓度，分别接种于96孔板中。经过一段时间的培养，观察每孔细胞的生长情况，筛选出克隆化的杂交瘤细胞。根据ELISA检测结果，确定单克隆抗体的特异性。本研究中，共获得10个单克隆抗体，其中4个抗体对VP1蛋白具有高亲和力。

(3)单克隆抗体的产量和稳定性是评估其应用价值的重要指标。本研究中，通过反复优化培养条件，如培养基成分、温度、pH值等，提高单克隆抗体的产量。结果表明，优化后的培养条件下，单克隆抗体的产量从最初的1mg/L提高到5mg/L。此外，对单克隆抗体进行稳定性测试，包括高温、低温、冻融循环等条件下的稳定性。结果显示，单克隆抗体在-20℃保存3个月后，活性无明显下降，表明其具有良好的稳定性。在后续的抗原表位鉴定实验中，所制备的单克隆抗体表现出良好的特异性和灵敏度。

1.3抗体特异性验证

(1)抗体特异性验证是确保单克隆抗体质量的关键步骤。本研究采用间接ELISA方法对制备的单克隆抗体进行特异性验证。首先，将纯化的VP1蛋白包被于96孔板，作为抗原。随后，将制备的单克隆抗体稀释后加入孔中，室温孵育。孵育完成后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG作为二抗，继续孵育。最后，加入底物