药品微生物检验技术 课件 模块二 项目五 细菌内毒素检查.pptx

《药品微生物检验技术》模块二药品安全性检查项目五细菌内毒素检查

任务一鲎试剂的灵敏度复核试验任务二碳酸氢钠注射液的干扰试验任务三碳酸氢钠注射液中细菌内毒素的检查目录

项目五细菌内毒素检查任务一鲎试剂的灵敏度复核试验

任务引入请思考凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。鲎试剂是从鲎（见图2-5-1）的血液中提取出的冻干试剂，可以与细菌内毒素发生凝集反应。某企业近期新采购了一批鲎试剂，根据《中国药典》2020年版要求，在对供试品进行细菌内毒素检查之前，首先要进行鲎试剂灵敏度复核试验。那么，鲎试剂灵敏度复核试验什么时候要做，什么时候可以省略不做呢？

任务分析当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。鲎试剂复核后才可以使用，以后使用同批次鲎试剂可不进行复核。本任务的工作内容及要求见表2-5-1。

相关知识取细菌内毒素国家标准品或工作标准品1支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮药品微生物检验技术在瓶颈上部轻轻划痕，用75%乙醇擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。一、细菌内毒素标准溶液的制备根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将标准品用细菌内毒素检查用水溶解，用封口膜将瓶口封严，放置在旋涡混合器上混匀15min或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作，然后制成２λ、λ、0.5λ和0.25λ４个浓度的细菌内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30s或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作。

相关知识取0.1mL/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，用75%乙醇擦拭后启开备用，应防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1mL检查用水，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，溶解过程中应避免产生气泡。若待复核鲎试剂规格不是0.1mL/支时，取若干支按标示量加入细菌内毒素检查用水溶解，充分混匀后每0.1mL分装到1支试管中，至少分装18支管备用。二、待复核鲎试剂的准备

相关知识将已充分溶解的待复核鲎试剂18支管放在试管架上，排成5列，取不同浓度（即2λ、λ、0.5λ和0.25λ）的细菌内毒素标准溶液，分别与等体积（0.1mL）的鲎试剂溶液混合，每一个内毒素浓度行做4管；另外取2管加入等体积的细菌内毒素检查用水作为阴性对照。加样结束后，将试管中溶液轻轻振动混匀，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃的试管恒温仪中，保温60min±2min。三、加样试管恒温仪

相关知识将试管从试管恒温仪中轻轻取出，缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（+）。保温和拿取试管过程应避免振动，防止造成假阴性结果。四、结果观察与记录当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。五、结果计算式中，Ｘ为反应终点浓度的对数值（lg），反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；ｎ为每个浓度的平行管数，即4。

相关知识λc在0.5λ～２λ（包括0.5λ和2λ）时，判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰试验和供试品细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。六、结果判断

任务实施一、制订工作计划序号工作内容完成时间成员负责人1玻璃器皿的洗涤与灭菌2细菌内毒素标准溶液的制备3待复核鲎试剂的准备4加样、观察与记录5结果计算与判断根据任务要求，制定合理工作进度计划，并根据小组成员的特点进行分工。

任务实施二、试验前准备设备、器材、试剂规格数量用途电热干燥箱去除外源性内毒素水银温度计或酒精温度计测量温度旋涡混合器混合细菌内毒素标准品稀释溶液鲎试剂供试品细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品制备细菌内毒素标准溶液细菌内毒素检查用水稀释细菌内毒素标准品、鲎试剂移液管、无热原吸头、试管（１０ｍｍ×７５ｍｍ）、烧杯、试管架、洗耳球、计时器、７５％乙醇、棉球、剪刀、砂