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ARDS小鼠气道上皮杯状细胞表达水平的变化及机制

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ARDS小鼠气道上皮杯状细胞表达水平的变化及机制

摘要：急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种常见的危重症，其病理生理机制复杂。本研究通过建立ARDS小鼠模型，探讨气道上皮杯状细胞表达水平的变化及其机制。研究发现，ARDS小鼠模型中气道上皮杯状细胞表达水平显著升高，且其升高与炎症反应密切相关。本研究进一步通过基因敲除和过表达实验证实，杯状细胞在ARDS的发生发展中起关键作用。本研究揭示了ARDS小鼠气道上皮杯状细胞表达水平的变化及其机制，为ARDS的防治提供了新的思路。

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种常见的危重症，其发病率和死亡率高，严重威胁患者生命安全。ARDS的发病机制复杂，涉及炎症反应、肺泡毛细血管屏障损伤等多个方面。气道上皮杯状细胞是呼吸道上皮细胞的一种，其主要功能是分泌黏液，维持呼吸道正常生理功能。近年来，越来越多的研究表明，气道上皮杯状细胞在ARDS的发生发展中起着重要作用。本研究旨在通过建立ARDS小鼠模型，探讨气道上皮杯状细胞表达水平的变化及其机制，为ARDS的防治提供新的思路。

一、1.材料与方法

1.1实验动物

(1)实验动物选用健康C57BL/6小鼠，雌雄各半，体重18-22克，由本实验室动物中心提供。所有动物在实验前均进行适应性饲养，饲养条件为室温22-25°C，相对湿度40%-70%，12小时光照与12小时黑暗交替。实验动物饲养于通风良好的动物笼中，笼底铺有木屑，保证动物的生活环境舒适。

(2)在实验开始前，对动物进行编号，并详细记录每只动物的性别、体重、出生日期等信息。实验过程中，每日监测动物的饮食、活动状态及生理指标，确保实验动物处于健康状态。实验期间，对动物进行分组，分为对照组、ARDS模型组、基因敲除组、过表达组，每组10只小鼠。对照组给予等量生理盐水灌胃，ARDS模型组给予脂多糖（LPS）诱导建立ARDS模型，基因敲除组通过CRISPR/Cas9技术敲除杯状细胞相关基因，过表达组通过慢病毒转染过表达杯状细胞相关基因。

(3)在实验过程中，对小鼠进行麻醉，通过解剖观察肺组织病理变化，并通过ELISA检测肺泡灌洗液中炎症因子水平。同时，收集小鼠气道上皮细胞，采用免疫荧光技术检测杯状细胞表达水平。实验数据采用统计学方法进行统计分析，以P0.05为差异具有统计学意义。实验结束后，对动物进行安乐死处理，并记录死亡原因。

1.2ARDS小鼠模型的建立

(1)ARDS小鼠模型的建立采用脂多糖（LPS）诱导法。首先，将小鼠随机分为对照组和ARDS模型组，每组10只。对照组给予等量生理盐水灌胃，ARDS模型组给予LPS（10mg/kg）腹腔注射。注射后，观察小鼠的呼吸频率、活动状态等生理指标变化。

(2)注射LPS后，小鼠出现明显的呼吸急促、活动减少、呼吸音粗糙等症状，符合ARDS的临床表现。通过呼吸频率监测，ARDS模型组小鼠的呼吸频率显著高于对照组（P0.05），表明模型建立成功。此外，通过肺组织病理学观察，ARDS模型组小鼠肺组织出现明显的水肿、炎症细胞浸润、肺泡壁破坏等病理变化，进一步证实了ARDS模型的成功建立。

(3)在模型建立成功的基础上，对小鼠进行进一步的实验处理。通过ELISA检测肺泡灌洗液中炎症因子（如IL-6、TNF-α）水平，结果显示ARDS模型组小鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平显著升高（P0.05），与临床ARDS患者检测结果相符。此外，通过对小鼠进行实时荧光定量PCR检测，发现ARDS模型组小鼠肺组织中炎症相关基因（如NF-κB、IL-1β）表达上调，进一步证实了ARDS模型的可靠性。

1.3实验分组与处理

(1)实验动物随机分为对照组、ARDS模型组、基因敲除组和过表达组，每组10只小鼠。对照组给予等量生理盐水灌胃，ARDS模型组给予LPS（10mg/kg）腹腔注射建立ARDS模型。基因敲除组通过CRISPR/Cas9技术敲除杯状细胞相关基因，过表达组通过慢病毒转染过表达杯状细胞相关基因。所有动物在实验开始前适应性饲养3天，确保实验条件一致。

(2)基因敲除组小鼠在适应性饲养结束后，进行CRISPR/Cas9基因编辑操作。具体操作步骤为：将构建好的sgRNA和Cas9蛋白注射入小鼠胚胎，筛选出敲除成功的基因型小鼠。过表达组小鼠同样在适应性饲养结束后，通过慢病毒转染技术将过表达载体转染入小鼠肺泡上皮细胞，筛选出过表达成功的基因型小鼠。

(3)在基因编辑和过表达操作成功后，对各组小鼠进行相同的处理，包括LPS诱导建立ARDS模型。在实验过