细菌原生质体育种技术及其应用进展.ppt

剩余菌数测定：取0.5mL上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4稀释液各0.1mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数四、实验过程四、实验过程原生质体融合取两个亲本的原生质体悬液各1mL混合，放置5min后，2500r/min离心10min，弃上清液。于沉淀中加入0.2mLSMM溶液混匀，再加入1.8mLPEG溶液，轻轻摇匀，置36℃水浴保温处理2min，2500r/min离心10min，收集菌体，将沉淀充分悬浮于2mLSMM液中。四、实验过程原生质体再生用双层培养法，先倒再生补充基本固体培养基(SMR)作底层，取0.5mL原生质体悬液，用SMM作适当稀释，取10-3、10-4、10-5稀释液各1mL，加入底层平板培养基的中央，再倒入上层再生补充半固体培养基混匀，36℃培养48h。分别计算二亲株的原生质体的再生率，并计算其平均数。细菌原生质体育种技术及其应用进展目录一、前言二、研究现状三、细菌原生质体融合育种原理四、实验过程五、影响细菌原生质体融合的因素六、应用进展七、意义及展望一、前言原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。一、前言原生质体融合育种技术是细菌遗传育种的有效方法之一，发展迅速，应用广泛。文中综述了亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍了细菌原生质体融合技术在遗传育种中的应用，并展望了细菌原生质体融合技术的发展前景。二、研究现状细菌原生质体融合是20世纪70年代发展起来的重要基因重组技术。1976年FODORK等采用聚乙二醇（PEG）、磷酸钙诱导巨大芽孢杆菌原生质体的融合，SCHAEFFEP等报道了用PEG诱导枯草芽孢杆菌的原生质体融合，这2项重要研究成果同时发表在美国科学院院报上，是细菌原生质体融合技术发展的里程碑，经过30余年的发展，已经成为细菌遗传育种的一项基本技术。01040203克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。三、细菌原生质体融合育种原理四、实验过程实验材料：菌种：枯草芽孢杆菌T4412、枯草芽孢杆菌TT2四、实验过程（一）实验材料：2、培养基(1)完全培养基(CM，液体)；(2)完全培养基(CM，固体)液体培养基中加入2.0%琼脂；(3)基本培养基(MM)；(4)补充基本培养基(SM)在基本培养基中加入20g/mL的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75Pa灭菌20min；(5)再生补充基本培养基(SMR)在补充基本培养基中加入0.5mol/L蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75Pa灭菌20min。(6)酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。实验材料：四、实验过程促融合剂40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM溶液。溶菌酶液酶粉酶活为4000u/g，用SMM溶液配制，终浓度为2mg/mL，过滤除菌备用。器皿养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、台式离心机、721比色计、细菌过滤器。四、实验过程实验材料：缓冲液0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液。高渗缓冲液：于上述缓冲液中加入0.8mol/L甘露醇。原生质体稳定液(SMM)0.5mol/L蔗糖、20mol/LMgC1?、0.02mol/L顺丁烯二酸，调pH6.5。原生质体融合育种流程：检出融合子促融合选择亲本反复原生质体再生遗传标记、选择性培