碱性磷酸酶的分离提取.pptVIP

实验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活测定的方法目的要求：1.原理碱性磷酸酶(AlkalinephosphataseEC3.1.3.1简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作中特别注意以下几点：取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量高的材料。用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。酶活力的分析：通常是以对-硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/LMg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物pNP在405nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405nm值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为：在37℃下，以2mmol/LpNPP为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2mmol/LMg2+的测活体系中每分钟催化产生1?mol/LpNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（Folin-Phenolreagent）显色法2操作方法2.1牡蛎碱性磷酸酶的分离提取每组称取20g牡蛎（蒸馏水洗净），加入50mL预先冷却的0.01mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5，含0.1mol/LNaCl），（两组一起）于高速组织捣粹机匀浆1min，于冰箱4℃放置1h进行抽提。室温离心，4000r/m20min，收集离心上清液，（两组分开）并量体积。（留2mL上清液，待测酶的比活力。）在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100mL加入20.9g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置0.5h。室温离心，4000r/m20min，收集离心上清液，并量体积。（留2mL上清液，对0.01mol/LTris-HCl缓冲液pH7.5含0.1mol/LNaCl透析平衡，待测酶的比活力。（不做））0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100mL加入23.8g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2h。得到沉淀物，溶于5mL含0.1mol/LNaCl的0.01mol/LTris-HClpH7.5。装入透析袋，对0.01mol/LTris-HClpH7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测出为止（可用一定浓度BaCl2溶液检验）。室温离心，4000r/m20min，收集沉淀物。取出酶溶液，冷冻高速离心（0℃25000r/m30min）。离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入棕色瓶于4℃冰箱保存。20g牡蛎加入50mL预先冷却的0.01mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5，含0.1mol/LNaCl），于高速组织捣粹机匀浆1min，于冰箱4℃放置1h进行抽提。室温离心，4000r/m20min，收集离心上清液，并量体积。匀浆液上清液缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100mL加入20.9g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1h。室温离心，4000r/m20min，收集离心上清液，并量体积。加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100mL加入23.8g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2h。室温离心，4000r/m20min，收集沉淀物。0.35饱和硫酸铵上清液沉淀溶于5mL含0.1mol/LNaCl的0.01mol/LTris-HClpH7.5。装入透析袋，对0.01mol/LTris-HClpH7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测出为止粗酶液2.2比活力测定对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）：取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作。管号01234567pNP含量(?mol)00.050.100.150.200.250.30