临床样本的采集运输和保存及核酸提取课件.ppt

临床标本的采集、处理、运送与保存及DNA/RNA提取;研究背景;研究背景;临床标本的正确采集、运送、保存

的重要性;〔一〕、样本的采集;标本采集的本卷须知;全血;血清〔浆〕;肝素的作用机理;〔二〕、样本的运送;〔三〕、样本的保存;研究背景;核酸提取的重要性;〔一〕、提取核酸总的原那么

;〔二〕、核酸提取的根本步骤;各种组织细胞破碎方法;2、核酸的别离与纯化：

将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其

他物质别离

非核酸的大分子污染物〔蛋白质、多糖和脂

类分子〕、非需要的核酸分子、试剂和溶液;3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤

沉淀可去除局部杂质与某些盐离子

参加一定的盐类〔醋酸钠、氯化钠等〕后使用有机溶剂〔如乙醇、异丙醇等〕

少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤;4.核酸的鉴定

浓度鉴定

纯度鉴定

完整性鉴定;浓度鉴定;RNA：;2〕荧光光度法

荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。

适用于低浓度核酸溶液的定量分析〔1-5ng〕;EB与DNA的结合

;纯度鉴定;完整性鉴定;DNA完整性鉴定：;;5、核酸的贮存——DNA保存;核酸的贮存——RNA保存：;三、基因组DNA的别离与纯化;〔一〕、DNA样品准备;DNA提取前样本采集、预处理和保存：;〔二〕、DNA提取;酚

抽

提

法

提

取

步

骤：;DNA酚抽提法示意图;主要试剂的作用：

EDTA：1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶；

2.降低细胞膜的稳定性;SDS的作用：

1.溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂

2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸

释放出来

3.对RNA、DNA酶有抑制作用

4.与蛋白质形成R-O-SO3….R蛋白质复合物，使蛋白质变性;蛋白酶K：

水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质

蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能

力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可

同时使用;苯酚：

蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性

苯酚溶于有机溶剂，微溶于水

提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率

氧化苯酚会破坏DNA;DNA的沉淀：;;〔三〕磁珠法：

磁珠在高盐低pH值下吸附核酸，在低盐高pH??下与核酸别离，再通过移动磁珠来获取DNA;〔四〕微柱法：

利用DNA在高盐、低pH的特定溶液环境下可吸附在固相介质〔如硅胶膜〕上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中;〔三〕、DNA的浓缩

;〔四〕、DNA回收;DNA降解的原因

样本不够新鲜，采集材料过陈旧

样本本身存在大量DNA酶

提取DNA的生物活性差的原因？

提取的基因组DNA盐浓度过高

基因组DNA中乙醇未去除净

基因组DNA中可能存在其他抑制因素

提取基因组DNA，有时参加蔗糖的原因

参加多糖，保护DNA长度;四、RNA的别离与纯化

;〔一〕、样本来源;每个细胞的RNA量约为10-5μg

80%-85%rRNA

10%-15%tRNA

1%-5%mRNA

其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA…;组织材料;〔二〕、RNA提取的独特性

—关于RNase酶;RNase酶;去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键

必须在总RNA提取别离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性;2.外源性RNA酶(extrinsicRNase)

主要来源：

被污染的缓冲液

细菌或微生物污染，高压不能去除RNA酶

自动移液装置;3.实验室采取防止RNA酶污染的措施

设置专门RNA移液装置

小份保存缓冲液

设置专门的RNA电泳装置

准备溶液或缓冲液时，使用无RNA酶的器皿、

DEPC处理水等

别离RNA过程中使用RNA酶抑制剂;4.RNA酶的去除;5.RNA提取所用器皿的处理;6.RNA提取所用溶液的准备;7.RNA提取中RNase污染的控制;〔三〕、用于提取RNA的血样的处理;〔四〕、RNA提取的常用方法;RNA提取实验前的准备;外表活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法：;异硫氰酸胍〔GuSCN〕结合氯仿-酚提取法;试剂的作用：;〔四〕、mRNA的别离纯化;TheEnd!