DB21T 2536-2015 副结核分支杆菌实时荧光PCR检测方法.docxVIP

ICS65.020.30B41

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2536—2015

副结核分支杆菌实时荧光PCR检测方法

Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis

2015-10-15发布2015-12-15实施

辽宁省质量技术监督局发布

I

DB21/T2536—2015

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：吴斌、万超、屈菲。

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DB21/T2536—2015

副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法

1范围

本标准规定了副结核分枝杆菌（Mycobacteriumaviumsubssp.paratuberculosis）实时荧光PCR检测方法。

本标准适用于副结核分枝杆菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

SN/T1193基因检验实验室技术要求

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Ct值：达到阈值的循环数（CycleThreshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

实时荧光PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）

4原理

采用TaqMan方法，比对副结核分枝杆菌基因组5端非编码区最保守的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5到3的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。

5试剂和材料

2

DB21/T2536—2015

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。

5.1试剂

5.1.1PBS：配制方法见附录A.1。

5.1.2Triton-X-100

5.1.3Trizol裂解液。

5.1.4三氯甲烷。

5.1.5柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液：配制方法见附录A.2。

5.1.675%乙醇：配制方法见附录A.3。

5.1.7异丙醇（-20℃预冷）。

5.1.84%氢氧化钠：配制方法见附录A.4。

5.1.94%硫酸：配制方法见附录A.5。

5.1.10其他试剂：荧光PCR反应缓冲液：含50mmol/LKCl：配制方法见附录A.6,10mmol/LTris-HCl（pH8.3）：配制方法见附录A.7,2.5mmol/LMgCl2：配制方法见附录A.8,5%二甲基亚砜（DMSO）：配

制方法见附录A.9，5%甘油：配制方法见附录A.10。可采用等效商品化试剂。

5.1.11dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)，UDG酶。

5.1.12引物：以副结核F57基因序列合成一对特异性引物：上游引物5-GTCAGCGGCGGTCCAG-3，下游引物5-GCAGCTCCAGATCGTCATTC-3，TaqMan探针（FAM）5-ACGAGCACGCAGGCATTCCAAGTC-3（BHQ-1）均配制成10umol/L，-20℃保存。

5.2仪器与耗材

5.2.1接种棒

5.2.2荧光PCR检测仪。

5.2.3