分子排阻色谱法操作程序草案项目lyllihui.pdfVIP

方法：

分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。常用于蛋白质

分子量及纯度的测定。分子排阻色谱法的分离原理为分子筛。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶

或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺

寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内，

大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗

脱至柱外，表现为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，

在色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子按分子大小依次被洗脱。

适用范围：

适用于本公司B项目蛋白产品的原液及制剂成品纯度分析，也可用于中间产品的纯度分析。

职责：

操作人员：

严格按照此规程要求进行操作。

岗位主管：

起草文件，并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新；

监督操作规程是否与实际过程一致，资源是否满足要求；

培训，确保此操作规程的正确实施。

程序：

1术语解释

无

2仪器设备

2.1色谱柱：TSKgelG3000SWXL，7.8mm×30cm

2.2高效液相色谱仪：Agilent1200或Agilent1260。

3试剂

3.1NaSO（色谱纯）；KHPO（色谱纯）；KOH（色谱纯)；HCl（分析纯）；纯化水（）。

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4溶液配制

4.1流动相配制

4.1.1流动相（100mMKHPO/100mMNaSO）

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称取KHPO13.6g和NaSO14.2g，加入超纯水溶解，用KOH调pH至6.70±0.02并最

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后定容至1000ml，即得。

使用0.45μm滤器过滤后2-8℃，在1个月内使用。每次使用前请重新调pH值至

6.70±0.02，并过滤，超声脱气15分钟。

4.1.2色谱柱保存液

含20%乙醇的流动相，使用0.45μm滤器过滤后2-8℃，6个月内使用。

4.2溶液配制

4.2.1对照品及质控样品的配制：

市售对照品：贝伐珠单抗注射液，Roche。

对照品：重组抗VEGF人源化单克隆抗体注射液，。

质控样品：采用供试品缓冲液或流动相稀释至目标浓度的对照品溶液。

4.2.2空白对照溶液：

a.a双羧海藻糖60mg/ml，一水磷酸二氢钠5.8mg/ml，无水磷酸氢二钠1.2mg/ml，聚山

梨酯200.40mg/ml，1M氢氧化钠调pH至5.9。

4.2.3供试品配制：

若样品为冷冻状态，室温融化。将样品装在一个离心管内，多次上下颠倒离心管混合样

品并取出至少0.1ml使用。

若样品为非冷冻状态，多次来回颠倒样品容器混合样品并取出至少0.1ml使用。

每个样品混合30～45秒。

对于浑浊的样品（如细胞碎片），需经过0.22μm的滤膜过滤，或者经10000rpm离心10

分钟后迅速将上清液转移至进样瓶。

5上样操作

5.1操作控制参数

流动相100mMKHPO/100mMNaSO，pH6.7±0.02

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