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2025-03-02 发布于广东
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酵母单杂交系统

主讲人：

酵母单杂交系统概述

酵母单杂交原理

酵母单杂交应用

实验操作步骤

注意事项与技巧

研究进展与展望

酵母单杂交系统概述

系统定义

酵母单杂交系统的基本原理

酵母单杂交系统利用酵母细胞内转录因子与启动子的相互作用，检测蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA的相互作用。

系统组成与关键组件

该系统包括报告基因、启动子、DNA结合域和激活域，其中报告基因的表达指示了相互作用的存在。

实验操作流程

实验涉及构建含有特定启动子的酵母菌株，转化含有待测蛋白的DNA结合域融合蛋白，并检测报告基因的表达。

研究背景

酵母单杂交系统起源于1989年，由StanFields和MikeWigler发明，用于研究蛋白质与DNA的相互作用。

酵母单杂交系统的起源

自发明以来，酵母单杂交系统经过多次改进，成为研究基因调控网络的重要工具。

酵母单杂交系统的发展

酵母单杂交原理

基本原理

报告基因的表达调控

转录因子与启动子的相互作用

酵母单杂交系统利用转录因子与特定DNA序列的结合特性，检测蛋白质-DNA相互作用。

通过融合转录因子与激活域，酵母单杂交系统可以控制报告基因的表达，实现信号放大。

筛选与鉴定转录调控因子

利用酵母单杂交系统，可以筛选出能够激活特定报告基因表达的转录调控因子。

操作机制

酵母单杂交系统中，启动子区域与报告基因融合，当转录因子结合时激活报告基因表达。

启动子区域的激活

通过构建转录因子库，利用酵母单杂交系统筛选出能激活报告基因的特定转录因子。

转录因子的筛选

通常选用易于检测的报告基因，如lacZ或HIS3，以反映转录因子的活性。

报告基因的选择

结合负筛选和正筛选，确保筛选出的转录因子特异性高，避免假阳性结果。

负筛选与正筛选的结合

信号传导路径

信号传导常涉及一系列蛋白激酶的磷酸化反应，形成级联放大效应，传递信号。

磷酸化级联反应

信号传导路径中，转录因子被激活后，可进入细胞核调控特定基因的表达。

转录因子激活

优势与局限

酵母单杂交系统能检测低水平的转录因子活性，适用于研究基因调控网络。

高灵敏度检测基因表达

该系统操作相对简单，实验周期短，易于在实验室中快速应用和推广。

操作简便性

与其他复杂的生物技术相比，酵母单杂交系统成本较低，适合资源有限的研究环境。

成本效益

酵母单杂交系统可能产生假阳性结果，需要通过其他实验方法进行验证。

局限性：假阳性问题

酵母单杂交应用

基因功能研究

酵母单杂交系统用于鉴定特定转录因子与启动子区域的相互作用，揭示基因表达调控机制。

基因表达调控

通过酵母单杂交筛选与疾病相关基因相互作用的蛋白，为疾病机理研究提供线索。

疾病相关基因分析

利用酵母单杂交系统验证候选药物靶点蛋白与特定基因的结合能力，加速药物开发进程。

药物靶点验证

蛋白质相互作用

酵母单杂交系统用于识别特定DNA序列的转录因子，如通过筛选能激活报告基因的蛋白。

鉴定转录因子

利用酵母单杂交系统分析信号传导途径中蛋白质的相互作用，例如研究受体与下游效应器的结合。

研究信号传导途径

通过酵母单杂交筛选，可以发现与特定疾病相关的蛋白质相互作用，为药物开发提供靶点。

发现药物靶点

酵母单杂交系统有助于解析蛋白质复合体的组成，例如研究核糖体或染色质修饰复合体的组分。

分析蛋白质复合体

药物筛选平台

利用酵母单杂交系统进行高通量药物筛选，快速识别潜在的药物候选分子。

高通量筛选

通过分析酵母中的报告基因表达，评估药物对特定基因调控的影响。

基因表达分析

酵母单杂交系统揭示药物如何与目标蛋白相互作用，阐明其作用机制。

药物作用机制研究

疾病模型构建

利用酵母单杂交系统研究特定基因在疾病状态下的表达调控，如癌症相关基因。

基因表达调控研究

通过酵母单杂交筛选与疾病相关的转录因子，验证潜在药物靶点的有效性。

药物靶点验证

实验操作步骤

实验设计

选择适合单杂交实验的酵母菌株，如Saccharomycescerevisiae，确保实验的准确性。

选择合适的酵母菌株

优化酵母培养基成分、温度和时间等条件，以提高实验的灵敏度和特异性。

优化实验条件

构建含有报告基因的载体，如lacZ或HIS3，用于检测转录因子与启动子的相互作用。

构建报告基因载体

设计特异性引物用于PCR扩增目标DNA序列，确保后续实验中DNA片段的正确插入。

设计特异性引物

菌株与载体构建

通过醋酸锂法将载体转化进酵母菌株，利用选择性培养基筛选成功转化的菌落。

构建含有报告基因和选择标记的载体，确保其能在酵母中稳定复制和表达。

选择适合单杂交系统的酵母菌株，如Saccharomycescerevisiae，因

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