巴斯德毕赤酵母表达系统.pptVIP

报告人：彭平平起源及背景巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是8O年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。0130年前KoichiOgata首次发现有些酵母可以利用甲醇为唯一的碳源和能源.0270年代Philipspertoleum公司就开发出高密度连续发酵生产毕赤酵母的工艺(细胞干重130g/L)。0380年代由Philipspertoleum公司合作开发毕赤酵母表达外源基因的研究。研究人员分离了醇氧化酶（AOX）的基因和启动子，构建了载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作的相关技术。011993年Philipspertoleum公司委托Invrtigone公司代理毕赤酵母表达系统的产品。01毕赤酵母与其它表达系统相比有许多优点1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcoholoxidase，AOX)基因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含1，3连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用于临床应用使用方便、简单，而且成本较低结构特点单细胞微生物兼性厌氧菌，易于进行遗传操作和培养具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、折叠、二硫键的形成和糖基化，可以获得高产量的蛋白合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，亦不会对细胞产生毒害01在微体中，有大量过氧化物酶合成，甲醇代谢的第一步就是在其中进行的，这样可以避免甲醇在AOX催化下产的H202对细胞的毒害。02微体（也称过氧化物酶体）醇氧化酶（AOX）01甲醇AOX甲醛02H2O2微体03细胞04毕赤酵母质粒载体穿梭质粒：是指人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。同源基因重组：同源染色体的非姐妹染色单体的交叉互换引起的互换重组AOX--醇氧化酶01S---分泌信号02MCS–多克隆位点03TT---终止信号04HIS4--组氨醇脱氢酶05Kanamycin---抗卡拉霉素基因06pBR322---大肠杆菌的复制起始位点07Ampicillin---抗氨苄青霉素基因08外源蛋白的引入表达Mut5’AOX基因3’AOX基因表型Mut+存在存在正表型Muts缺失存在缓慢型Mut-缺失缺失负型选择过程HIS4缺陷培养基G418酵母培养基低高G418：是一种氨基糖苷类抗生素，Kanamycin抗性基因能对抗G418对酵母的毒性导入质粒*