免疫胶体金的制备(康柳英).ppt

免疫胶体金的制备

原理

制备过程

1.胶体金的制备

2.胶体金标记蛋白

3.胶体金标记蛋白的纯化

原理

氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。

一.胶体金的制备

胶体金溶液制备的基本原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的胶体金粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。

常用方法

1．柠檬酸三钠还原法

2．鞣酸—柠檬酸三钠还原法

3.白磷还原法

4.抗体血酸还原法

5.硼氢化钠还原法

6.乙醇超声波还原法

方法

胶体金粒子大小

柠檬酸三钠还原法

10～160nm

鞣酸—柠檬酸三钠还原法

3～16nm

白磷还原法

5～12nm

抗体血酸还原法

8～13nm

硼氢化钠还原法

2～5nm

乙醇超声波还原法

6～10nm

步骤(柠檬酸三钠法)

(1)取5000ml圆底烧瓶一个，加4000ml双蒸水及160ml1%氯化金，加热沸腾2-5分钟；

(2)根据需要准确加入不同量的2％柠檬酸三钠水溶液，混匀，再保持沸腾5分钟，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则颜色偏向紫色。

(3)冷却后以蒸馏水恢复到原体积。

金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶，见附表

１％柠檬酸三钠ml

0.30

0.45

0.70

1.00

1.50

2.00

金溶胶颜色

蓝灰

紫灰

紫红

红

橙红

橙

吸收峰(nm)

220

240

535

525

522

518

径粒(nm)

147

97.5

71.5

41

24.5

15

注意事项

（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒

（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。

（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。

（4）氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。

（5）胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存1-2个月。但决不可保存在0℃以下，否则金粒子发生凝聚。

二.胶体金标记蛋白的制备

1.蛋白质的处理

2.蛋白与胶体金结合最佳pH确定

3.最小蛋白浓度的确定

4.胶体金与蛋白质的结合

5.胶体金标记蛋白的纯化

蛋白质的处理

目的:

（1）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。

（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。

（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30KD),形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。

蛋白与胶体金结合最佳pH确定

1.取若干个1.5ml试管，分别加入1ml胶体金

2.用1%K2CO3将pH分别调为6，7，8，9，10；（20#管在7左右，实际中我们绝大部分是按变色点来选）

3.按pH从低到高分别加入20ul浓度为1mg/ml的蛋白，混合，室温下放置15min；

4.观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH

最小蛋白浓度的确定

1.取若干个1.5ml试管，每个分别加入最佳pH的胶体金1ml；

2.依次加入不同量的蛋白（一般浓度为0.5-1mg/ml）1～20ul，（一般抗体按10，15，20ug/