DB21T 2628-2016 鱼类物种鉴定 PCR-RFLP 结合基因芯片.docxVIP

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DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2628—2016

鱼类物种鉴定PCR-RFLP结合基因芯片

分析法

theidentificationoffishspecies—

themethodofPCR-RFLPcombinedwithgenechip

2016-05-09发布2016-07-09实施

辽宁省质量技术监督局发布

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DB21/T2628—2016

前言

本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第一部分标准的结构和编写》给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：大连出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：闫平平、齐欣、田卓、崔妍、徐文英、刘莹、曲世超、尚宝玉、陈溪、黄大亮。本标准系首次发布的地方标准。

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DB21/T2628—2016

鱼类物种鉴定PCR-RFLP结合基因芯片分析法

1范围

本标准规定了远洋捕捞鱼类和沿海地区经济鱼类物种鉴定方法PCR-RFLP结合基因芯片分析法的技术规范要求。

本标准适用于鱼体肌肉组织，鱼糜及其鱼制品中鱼基因组的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1物种

物种是生物分类学的基本单位，也是生物繁殖的基本单元。物种是互交繁殖的相同生物形成的自然群体，与其他相似群体在生殖上相互隔离，并在自然界占据一定的生态位。

3.2PCR-RFLPpolymerasechainreactionrestrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态性聚合酶链式反应

3.3基因芯片

基因芯片也叫DNA芯片、DNA微振列、寡核苷酸阵列。基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。

4抽样与制样

将实验室样品粉碎，充分混匀后待用。

5防污染措施

PCR检验过程的防污染措施应符合GB/T27403的规定

6原理

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RFLP是根据不同品种基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点直接发生了碱基的直接插入、缺失，导致酶切片段大小发生变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种的DNA水平的差异，多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。PCR-RFLP的基本原理是PCR扩增目的DNA扩增产物在有特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在基因芯片分析仪上分辨，不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同程度的DNA片段条带。

7仪器设备

7.1电子天平：感量0.001g

7.2台式离心机（最高转速15000g），台式小型离心机

7.3双温水浴锅（37℃±1、65℃±1）

7.4漩涡振荡器

7.5低温冰箱（2℃-8℃)、冷藏冷冻冰箱（-20℃)

7.6荧光PCR仪;

7.7高压灭菌锅

7.8实时荧光PCR仪

7.9芯片电泳仪(2100生物分析仪)。

7.10微量可调移液器及配套吸头

8主要试剂

除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和Dnase的分析纯或生化试剂。条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T27025的规定。

8.1DNA提取试剂盒

8.2PCR-RFLP鱼种鉴定试剂盒(包括PCR扩增试剂盒和限制性内切酶酶切试剂盒)，试剂盒内包括细胞色素b基因特异性片段扩增用2×PCRMasterMix、PrimerMix、dH2O、限制性内切酶DdeI、HaeIII、NlaIII及Buffer等。

8.3DNA1000芯片试剂盒；

8.4其他PCR相关制品均购自生物公司。

9检测步骤

9.1样品预处理

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剪取样品50~100mg大小的组织，混合均匀后捣碎后放入1.5mL