高效液相色谱法 (7).ppt

*梯度淋洗(gradientelution)梯度淋洗是指在分离过程中使流动相的组成随时间改变而改变。通过连续改变色谱柱中流动相的极性、离子强度或pH等因素，使被测组分的相对保留值得以改变，提高分离效率。梯度淋洗对于一些组分复杂及容量因子值范围很宽的样品分离尤为必要。HPLC中的梯度淋洗的作用十分类似于气相色谱中的程序升温，两者的目的都是为了使样品的组分在最佳容量因子值范围流出柱子，使保留时间过短而拥挤不堪、峰形重叠的组分或保留时间过长、峰形扁平、宽大的组分，都能获得良好的分离。梯度淋洗的优点：可以改进复杂样品的分离，改善峰形，减少拖尾并缩短分离时间。另外，由于滞留组分全部流出柱子，可保持柱性能长期良好。第28页，共60页，星期日，2025年，2月5日*固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。高效液相色谱固定相和流动相第29页，共60页，星期日，2025年，2月5日*由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：1.化学惰性，不与固定相和被分离组分发生化学反应，保证柱的稳定性和分离的重现性。2.适用的物理性质，包括沸点较低，以便于分离组分和溶剂回收;低粘度，利于提高传质速率和分离速度、降低柱前压;弱或无紫外吸收等，以降低UV检测器本低响应，提高检测灵敏度;对样品具有适当溶解能力等。3.溶剂清洗和更换方便，毒性小、纯度高、价廉等，便于操作和安全。流动相第30页，共60页，星期日，2025年，2月5日*1.溶剂强度参数ε0定义为溶剂分子在单位吸附剂表面积上的吸附自由能，表征溶剂分子对吸附剂的亲和力大小。2.溶解度参数δ它是溶剂与溶质分子间各种作用力的总和，包括色散力、偶极作用力、接受质子能力、给于质子能力等。3.极性参数P’表示每种溶剂与乙醇、二氧六环和硝基甲烷三种极性物质相互作用力的度量，类似于气相色谱固定液的Rohrschneider常数，反映溶剂接受质子、给出质子和偶极相互作用能力及选择性差异，亦作为表征溶剂洗脱强度的指标。流动相溶剂的特性参数第31页，共60页，星期日，2025年，2月5日*第32页，共60页，星期日，2025年，2月5日*优化保留值k和分离选择性α的重要方法是改变流动相溶剂类型和组成。溶剂组成优化用差试法比较麻烦、费时，成功率不一定很高。采用溶剂组成与溶剂强度参数关系的估算,可减少优化实验操作。二元混合溶剂极性参数P’与其体积组成呈线性关系，可按算数平均值求出。例如溶剂A和B混合物的极性参数PAB’可按下式求出:混合溶剂ФA与ФB分别表示溶剂A和溶剂B在混合溶剂中的体积分数。第33页，共60页，星期日，2025年，2月5日*高效液相色谱法的主要类型根据分离机制不同，可分为以下几种类型：分配色谱法，包括液-液分配色谱法和化学键合相色谱法；液-固吸附色谱法；离子交换色谱法；尺寸排阻色谱法；亲和色谱法。第34页，共60页，星期日，2025年，2月5日*研究最多、应用最广泛的高效液相色谱类型。可分为液-液色谱和化学键合相色谱。前者是早期主要分配色谱类型，以物理吸附涂渍固定液在多孔载体表面上为固定相；后者以键合相为固定相，即化学键合固定相至载体或基质表面。化学键合相色谱巳成为占绝对优势的分配色谱类型。分配色谱(PartitionChromatography)第35页，共60页，星期日，2025年，2月5日*液-液分配色谱(LLPC)固定相载体和固定液（常选用几种极性不同的固定液）流动相要求：对固定相的溶解度尽可能小分类正相分配色谱流动相的极性固定相的极性适用于极性化合物的分离反相分配色谱流动相的极性固定相的极性适用于非极性化合物的分离分离原理：与液液萃取相同。第36页，共60页，星期日，2025年，2月5日*