EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析解析.ppt

EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析

广州医科大学附属第一医院病理科

林毅妍

序言

近年来，以表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）为治疗靶标的分子靶向治疗在非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC）治疗中越显突出。EGFR基因的检测不仅可认为分子靶向药物的使用提供有效指导，也可认为肺癌治疗措施的制定以及肺癌预后的鉴定提供重要信息。目前临床病理工作中，对EGFR基因扩增的检测使用较多的措施有荧光免疫原位杂交（FISH）技术、免疫组化（IHC）检测技术、PCR扩增检测技术等。本文将对荧光原位杂交与免疫组化两种检测进行比较分析。

材料

标本来源：广州医科大学第一附属医院1月～1月行支纤镜及手术切除的NSCLC病例，其中男性21例，女性19例；年龄30～85岁，中位年龄58岁。所有标本均经10%中性缓冲福尔马林液固定，常规石蜡包埋。40例标本行持续切片，同步行FISH检测与免疫组化检测。

重要试剂与仪器

蛋白酶K，探针：GLPEGFR/CSP7探针（北京金菩嘉企业），胃蛋白酶消化液，人抗EGFR单克隆抗体（即用型）购于福州迈新生物企业。Dako杂交仪、观测用OlympusBX51型显微镜和NikonH600L荧光显微镜。

检测措施

（1）FISH检测：

3μm组织切片TO脱蜡至水

煮沸去离子水处理15min

室温下2×SSC中漂洗2次，每次5min

在组织上滴加蛋白酶K工作液，在37℃预热的孵育盒中消化3～5min

室温下用2×SSC溶液中洗涤2次，每次5min，乙醇梯度脱水，自然干燥

避光环境中，探针混合液滴于玻片杂交区域

在温度80℃的自动杂交仪中变性5min，42℃杂交16小时

第二天46℃水浴箱中2×SSC10min，0.1%NP40溶液洗涤5min，室温70%乙醇3min

暗处自然干燥玻片后加DAPI复染液，放于暗盒中复染5min

OlympusBX51型荧光显微镜在DAPI/FIFC/RHOD三色滤光镜激发下观测间期细胞荧光杂交信号

检测措施

（2）IHC检测：

3μm组织涂胶片，57℃烤片过夜，浸于二甲苯中脱蜡至水

在组织上滴加胃蛋白酶消化液，在37℃预热的孵育盒中消化30min

采用EnVision二步法，严格按照阐明书操作

成果判断

（1）FISH成果鉴定：红色信号代表检测的靶基因，绿色信号代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测EGFR基因计数100个细胞，记录Ratio值（100个细胞核中红色信号数/100个细胞核中绿色信号数）。

FISH阳性分为：EGFR基因扩增：

①Ratio≥2为阳性成果；

②≥15个红色信号的细胞数占细胞总数的10%以上；

③出现成团红色信号的细胞；高多体性：Ratio＜2，但≥4个红色信号的细胞数占细胞总数的40%以上。

FISH阴性：Ratio＜2为无扩增。

成果判断

（2）IHC成果鉴定：染色成果根据细胞膜着色的阳性细胞百分率和阳性染色程度评价。

着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分；6～25%阳性细胞为1分；26～50%阳性细胞为2分；＞50%阳性细胞为3分。

再结合染色强度，无色为0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分相乘，为其最终得分。

同一视野如有染色强度不一，取其平均值作最终得分。

0～1分为阴性（－），2～3分为弱阳性（1+），

4～6分为中等阳性（2+），6分以上为强阳性（3+）。

记录学处理

采用SPSS17.0记录软件进行描述性分析。

FISH技术与IHC法检测成果的比较使用x2检查。

成果FISH

图1.EGFRFISH（+）

（高多体）

图2.EGFRFISH（+）（点簇状）

图3.EGFRFISH（-）

成果IHC

+++

++

+

-

成果

FISH技术与IHC法检测EGFR的成果比较见表1。

FISH

IHC

合计

（-）

（1+）

（2+）

（3+）

（+）

6

5

2

2

15

（-）

19

5

1

0

25

合计

20

10

3

2

40

表1FISH技术与IHC法检测EGFR的成果比较

40例NSCLC标本中，FISH显示为阳性的15例，其中IHC检测EGFR体现为（—）的6例（40%），阳性的9例（60%）；FISH显示为阴性的25例，其中IHC检测EGFR体现为（—）的19例（76%），阳性的6例（24%）。

IHC检测阳性例数高于FISH检测阳性例数，差异无记录学意义（x2=5.184，P＞0.05）。

讨论

表皮生长因子受体(EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，