多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用.pptVIP

TE,98oC.TE+50mMKCl;94oC.Thepresenceof50mMsaltresultsinamuchhighermeltingtemperature.SomesequencesinstrongCpGislandsarenotdenaturedat94oC.TE,98oC.TE+1.6mMMgCl2,98oC.即使是在98°C，一些CpG岛区域并不能完全变性（TE+低浓度MgCl2）可检测降解DNA98oC加热80分钟98oC加热20分钟98oC加热5分钟由于MLPA探针识别序列仅约70nt，因此可用于DNA碎片的检测，即使长时间的对DNA样品加热导致其断裂也不会对最终检测结果造成大影响。MLPA工作流程变性样品DNA在98度下加热5分钟。杂交往变性后的样品中加入SALSA探针混合液和MLPA缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后，在60度下温浴杂交16个小时。连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。PCR加入引物，dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。杂交溶液体积:8μL杂交时间60°C杂交16小时，即使是延长到20小时也可以。溶液的盐浓度:盐浓度在杂交反应中为350mM。杂交温度:杂交温度62°C会导致杂交探针不稳定；杂交温度60°C会导致杂交速度变慢。MLPA工作流程变性样品DNA在98度下加热5分钟。杂交往变性后的样品中加入SALSA探针混合液和MLPA缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。PCR加入引物，dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。连接连接反应90%在两分钟之内完成，连接反应在5min到25min都可以。DNA连接酶的量非常重要过量的DNA连接酶易造成非特异连接连接反应中盐浓度降低到75mM.，由于探针Tm在低盐时会降低,故连接反应温度降低到54oC。连接酶为NAD(LigationbufferA)和镁离子（ligationbufferB）依赖的，因此，buffersAandB不能反复冻融。MLPA工作流程变性样品DNA在98度下加热5分钟。杂交往变性后的样品中加入SALSA探针混合液和MLPA缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。PCR加入引物，dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。引物混合液包含了一条荧光标记引物和一条未标记引物和dNTPs.对于不同的型号的毛细管电泳仪,可能需使用不同荧光标记的通用引物,其中ABI系列的毛细管的电泳仪需使用FAM标记的通用引物，Beckman系列的需使用Cy5.0标记的通用引物。有些探针对DNA酶活性较为敏感，由于DNA纯度可以影响DNA聚合酶活性，故DNA不纯可以导致部分探针信号较低。要求质控DNA与样本DNA提取方法一致.SALSADNA聚合酶与TaqDNA聚合酶类似，但浓度更高.PCR循环数影响不是很大.PCR终止是由于引物的消耗完.1234PCR反应MLPA工作流程变性样品DNA在98度下加热5分钟。杂交往变性后的样品中加入SALSA探针混合液和MLPA缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。PCR加入引物，dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。需要将片段大小和峰面积导到Excel中分析结果Coffalyser（）.毛细管电泳MLPA技术特点与主要应用领域MLPA技术特点单管PCR反应检测50种DNA序列的拷贝数差异。MLPA应用的拓展：--mRNA的相对定量--检测启动子区域的甲基化异常--检测已知突变如BRAFV600E只需20ng