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检测抗猫泛白细胞减少症病毒单克隆抗体的间接ELISA方法

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检测抗猫泛白细胞减少症病毒单克隆抗体的间接ELISA方法

摘要：本文旨在建立一种检测抗猫泛白细胞减少症病毒（FelinePanleukopeniaVirus,FPV）的单克隆抗体（MonoclonalAntibody,mAb）的间接ELISA方法。通过优化ELISA实验条件，包括包被抗原的浓度、酶联物质量浓度、反应时间和温度等，成功制备了高灵敏度、高特异性的检测系统。本研究对FPV单克隆抗体的检测方法进行了详细的描述，包括实验原理、操作步骤、结果分析和讨论。该方法在FPV单克隆抗体的检测中具有广泛的应用前景，有助于进一步研究FPV的免疫机制和疫苗研发。

猫泛白细胞减少症（FelinePanleukopenia,FP）是由抗猫泛白细胞减少症病毒（FelinePanleukopeniaVirus,FPV）引起的急性高度传染性疾病。FPV主要感染猫及其它猫科动物，对幼猫的危害尤为严重。近年来，随着宠物经济的快速发展，FPV的发病率和死亡率呈上升趋势。因此，开发高效、灵敏的FPV检测方法对于疾病的防控具有重要意义。单克隆抗体（MonoclonalAntibody,mAb）作为一种高效的诊断工具，在FPV的检测中具有重要作用。本文旨在建立一种基于间接ELISA的FPV单克隆抗体检测方法，为FPV的快速诊断和免疫研究提供技术支持。

一、1.材料与方法

1.1实验材料

(1)实验材料主要包括抗猫泛白细胞减少症病毒（FPV）抗原、标准品和样品，以及用于ELISA检测的各种试剂和耗材。FPV抗原由实验室自行制备，通过基因工程方法构建FPV病毒衣壳蛋白的表达载体，在大肠杆菌中表达纯化得到。标准品包括已知浓度的FPV抗原和阴性对照，用于校准ELISA检测系统的灵敏度。样品则包括疑似感染FPV的猫血清、猫粪便以及猫组织样本。

(2)用于ELISA检测的试剂包括辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG抗体、羊抗小鼠IgM抗体、酶标仪检测用的底物溶液、终止液、洗涤液等。这些试剂均购自国内外知名品牌，确保实验结果的准确性和可靠性。其中，HRP标记的抗体用于检测样品中的FPV单克隆抗体，底物溶液用于显色反应，终止液用于终止酶促反应，洗涤液用于清洗反应板。

(3)实验所需耗材包括96孔ELISA板、移液器、移液枪、吸头、微量离心机、水浴锅、振荡器、紫外-可见分光光度计等。96孔ELISA板用于进行ELISA实验，移液器、移液枪和吸头用于精确移取试剂和样品，微量离心机用于分离血清中的细胞成分，水浴锅用于控制反应温度，振荡器用于混合反应液，紫外-可见分光光度计用于测定吸光度值。所有耗材均符合实验要求，保证实验结果的稳定性和可重复性。

1.2实验方法

(1)实验方法主要包括抗原的制备与纯化、抗体包被、样品加样、酶联物质量添加、洗涤、显色和结果分析等步骤。首先，通过基因工程方法制备FPV病毒衣壳蛋白的表达载体，在大肠杆菌中进行表达，随后通过亲和层析等方法进行纯化。接着，将纯化的抗原包被在96孔ELISA板上，每孔加入一定量的抗原，置于室温下反应2小时。

(2)包被后的ELISA板用洗涤液充分洗涤，去除未结合的抗原。随后，向每孔中加入待测样品，包括疑似感染FPV的猫血清、猫粪便以及猫组织样本，以及已知浓度的FPV抗原标准品作为阳性对照和阴性对照。加入样品后，再次将板置于室温下反应1小时。

(3)反应结束后，用洗涤液清洗板，去除未结合的样品。然后，向每孔中加入酶联物质量，包括HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体或羊抗小鼠IgM抗体，以及底物溶液。在室温下避光反应30分钟，加入终止液终止反应。最后，使用紫外-可见分光光度计测定各孔的吸光度值，并通过标准曲线计算样品中FPV单克隆抗体的浓度。

1.3ELISA实验条件的优化

(1)在本实验中，我们对ELISA实验条件进行了全面优化，以提升检测FPV单克隆抗体的灵敏度和特异性。首先，针对抗原包被浓度，我们进行了梯度实验，将抗原浓度从1μg/mL逐步降低至0.01μg/mL，结果显示，抗原浓度为0.5μg/mL时，吸光度值稳定且信号强度适中，故选择此浓度进行包被。此外，通过对比不同温度和反应时间对吸光度值的影响，我们发现在37℃条件下，反应2小时可获得最佳结果。

(2)针对酶联物质量浓度，我们分别以1:100、1:200、1:400和1:800的比例进行稀释，结果显示，当酶联物质量浓度为1:200时，吸光度值与酶联物质量浓度呈线性关系，且背景干扰最小。在显色