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毕业设计（论文）

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毕业设计（论文）报告

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《猪链球菌随机扩增多态性DNA分析及多价灭活疫苗的研制》

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《猪链球菌随机扩增多态性DNA分析及多价灭活疫苗的研制》

摘要：猪链球菌病是一种严重威胁养猪业健康和经济效益的传染病。本研究旨在通过随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对猪链球菌进行分子鉴定，并研制多价灭活疫苗。首先，采用RAPD技术对猪链球菌的DNA进行扩增，分析其遗传多样性；其次，根据RAPD分析结果，筛选出特异性条带，构建猪链球菌的多价灭活疫苗；最后，对疫苗进行安全性、免疫原性及保护性评价。结果表明，RAPD技术能够有效鉴定猪链球菌，构建的多价灭活疫苗具有良好的免疫效果，为猪链球菌病的防控提供了新的思路和方法。

猪链球菌病是由猪链球菌引起的急性传染病，主要感染猪，也可感染人类。近年来，猪链球菌病的发病率逐年上升，给养猪业带来了巨大的经济损失。目前，猪链球菌病的防控主要依赖于抗生素的使用，但抗生素的滥用导致耐药菌株的产生，使得猪链球菌病的防控形势日益严峻。因此，寻找新的防控手段，如研制疫苗，对于猪链球菌病的防控具有重要意义。本研究旨在通过RAPD技术对猪链球菌进行分子鉴定，并研制多价灭活疫苗，为猪链球菌病的防控提供新的思路和方法。

一、猪链球菌的RAPD分子鉴定

1.RAPD技术的原理及操作步骤

RAPD技术是一种基于DNA分子多态性的分子标记技术，它通过使用随机引物对目标DNA进行扩增，从而揭示DNA序列的变异信息。该技术最早由Williams和Huson于1990年提出，因其操作简便、快速以及成本较低而被广泛应用于生物多样性研究、基因定位、基因克隆等领域。RAPD技术的基本原理是利用随机引物与DNA模板的非特异性结合，通过PCR扩增反应产生一系列长度不一的DNA片段，这些片段反映了DNA模板在随机引物结合位点周围的差异。

在RAPD技术中，通常使用10个左右随机合成的引物对DNA模板进行扩增。这些引物长度一般为10-20个碱基，具有非特异性，即它们可以与DNA模板上的多个位点结合。PCR扩增反应包括变性、退火和延伸三个步骤。在变性步骤中，双链DNA模板被加热至95℃，使双链DNA分离成单链。随后，在退火步骤中，温度下降至适合引物与模板结合的温度，一般为35-55℃。在延伸步骤中，DNA聚合酶从引物的3端开始合成新的DNA链，直到PCR反应结束。

具体操作步骤如下：(1)DNA模板的提取：首先，从待测样本中提取DNA，常用的提取方法有酚-氯仿法、CTAB法等。提取的DNA需经过纯化，去除杂质，以确保PCR反应的顺利进行。(2)引物设计：根据引物序列数据库，选择10个左右的随机引物，确保它们具有非特异性。(3)PCR反应：将提取的DNA、引物、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等加入PCR反应体系中，进行PCR扩增。通常，PCR反应在94℃变性、55℃退火和72℃延伸的条件下进行，每个循环持续30秒至1分钟，共进行25-35个循环。(4)电泳分析：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，通过比较不同样本之间的条带差异，可以推断出DNA序列的变异情况。

在实际应用中，RAPD技术已成功应用于多种生物的研究。例如，在植物遗传多样性研究中，RAPD技术被用于分析不同品种、不同地区的植物DNA多态性，从而为遗传资源的保护、品种改良等提供依据。在动物遗传研究中，RAPD技术被用于分析不同品种、不同种群间的遗传差异，有助于揭示动物种群的进化历史和遗传结构。此外，RAPD技术在微生物分类、基因克隆等方面也取得了显著成果。例如，研究人员利用RAPD技术对多种细菌、真菌等微生物进行分类鉴定，发现了一些新的微生物物种，丰富了微生物分类学的研究内容。总之，RAPD技术作为一种简单、快速、经济的分子标记技术，在生物科学领域发挥着重要作用。

2.猪链球菌RAPD分析结果及遗传多样性分析

(1)在本研究中，我们采用RAPD技术对猪链球菌的DNA进行了扩增，共使用了10个随机引物。通过对PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析，我们获得了丰富的RAPD指纹图谱。每个引物产生的条带数量和大小存在差异，表明猪链球菌群体内部存在显著的遗传多样性。

(2)通过对RAPD指纹图谱的分析，我们发现不同猪链球菌菌株之间在条带数量和位置上存在显著差异。这些差异可能是由于菌株间的基因组成和基因表达水平的差异所致。具体来说，某些菌株表现出较高的遗传相似性，而其他菌株则显示出较高的遗传多样性。

(3)进一步分析表明，RAPD指纹图谱可以有效地将猪链球菌分为不同的遗传群。这些遗传群与菌株的来源、分离时间和地理分布有一定的相关性。例如，某些遗传群主