神经生物学实验课细胞培养1.pptVIP

细胞培养;体外培养〔Invitro〕;原代培养

源自体内新鲜组织的细胞在体外条件下生长，在传代之前称为原代培养。

传代培养

细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。

;二、细胞培养技术的主要优点;在实验过程中，根据要求可始终保持细胞的活力，并可长时期的监控、检测甚至量评估一局部活细胞的情况，包括其形态、结构和生命活动等。这点是其他方法所无法取代的。;进行体外的细胞培养实验时，可以根据需要，控制物理化学的条件进行实验、观察。

〔包括PH、温度、O2、CO2、实验用的药物、试剂等〕;通过细胞培养所得到的细胞系属同一类型的细胞，可以到达均一性。利于单一细胞实验的定性和定量统计。;通过倒置相差显微镜外接照相,摄影等直接观察活的细胞；电子显微镜分析细胞的超微结构；同位素标记、放射免疫等方法检测细胞内物质的合成、代谢的变化等、通过激光共聚焦，荧光显微镜等来观察细胞内的物质的变化及检测细胞的凋亡等。

;; BGC-823细胞;多种学科均可利用细胞培养进行研究，如：细胞学、免疫学、肿瘤学、生化学、遗传学、分子生物学等。可供实验的组织来源众多，包括各种动物的各类组织，可以是动物的胚胎或成体，可以是正常组织或肿瘤组织等。;细胞培养可以大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的实验样本，因此有时可比体内实验经济的多。例如，一个需要100只鼠才能得出结论的实验可能用100片盖玻片或几个多孔培养板而获得具有相同统计学意义的结果。

;四、实验准备;1、实验所需仪器设备〔无菌室〕：

超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热枯燥箱，

滤器，酸缸

CO2培养箱

倒置显微镜

液氮罐

自动双重纯水蒸馏器或纯水仪;超净台;滤器;CO2培养箱;;自动双重纯水蒸馏器纯水仪;2、实验所需培养器皿：

培养瓶

培养皿

吸管

冻存管，等;3、实验所需手术器械：

剪刀

大镊子

直头和弯头眼科镊子

直头和弯头眼科剪等

;〔1〕培养基

〔2〕消化液

〔3〕清洗液;培养基;合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用??工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。

主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、

无机盐和其它一些辅助物质。

优点：标准化生产，组分和含量相对固定，本钱低

缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。;人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基〔如血清〕。;一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清．;血清质量好坏是实验成败的关键。

常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。

优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。

血清的灭活〔消除补体活性〕：56℃，30分钟

血清的消毒：过滤除菌;

在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。

通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。

庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定;完全培养基的组成;培养基的配制;

胰蛋白酶：作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞别离。

胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。

胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。

胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。

用含血清培养液终止其对细胞的消化作用;

EDTA：乙二胺四乙酸。是一种化学螯合剂，能够与细胞外表的粘附分子结合，破坏细胞之间的连接。一般使用浓度为0.02%。

由于EDTA不能用含血清培养液终止其对细胞的消化作用，所以使用后应将培养瓶彻底清洗，否那么再次培养时细胞容易脱壁。

用滤器过滤除菌。;清洗液;5、细胞培养所用玻璃

及塑料制品的清洗与消毒;清洗;玻璃器皿的清洗;浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉

新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃外表带有大量的干固的灰尘，且玻璃外表常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等

先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质

再次使用的玻璃器皿那么常附有大量刚使用过的蛋白质