疫组织化学的基本理论与技术.pptVIP

4．塑料包埋切片(plasticsection)常用的包埋材料有两大类：甲基丙烯酸盐类和环氧树脂类。前者能较好地保存抗原，不与组织产生共聚合，染色前不必脱去包埋材料，但形态结构欠佳，切片易皱折；后者能较好地保持形态结构，但在聚合过程中易与组织作用，改变抗原结构。优点：组织块可同时用于一般光镜切片、半薄切片(0.5～1.5μm)和电镜超薄切片。缺点：所经步骤繁琐，抗原活性易丧失。应用范围：塑料包埋切片主要用于免疫电镜超薄切片前定位。超薄切片超薄切片(ultrathinsection)适用于免疫电镜细胞化学，需用超薄切片机(详见有关电镜技术资料)。载玻片及盖玻片的处理和切片的附贴载玻片及盖玻片的处理载玻片：清洗液(酸)浸泡12-24h，水洗，95％乙醇浸泡2h后擦干或烤干。盖玻片：清洗液浸泡2h，或盐酸乙醇浸泡后水洗，95％乙醇浸泡，擦干。为防止染色过程脱片，适用免疫组化染色中的附贴剂：1甘油．明胶；2甲醛一明胶；3铬明矾-明胶；4多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)；5APES；6APES和Poly-L-lysine联合应用：适于特别容易脱片的情况。7切片的附贴免疫组织化学的染色方法及注意事项免疫组织化学染色方法按标记物种类分为：免疫酶法；免疫金一银法；铁标记法；免疫荧光法；双重或多重免疫染色法等。按标记抗体不同分为:直接法：抗原+一抗（标记物标记）镜下观察优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度差，所需抗体量大，不经济，淘汰。间接法：经过二次抗体抗原+一抗+二抗（标记物标记）特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体→鉴定多种抗原。非标记抗体桥法（桥连法、多步法）

经过三次抗体特点：任何抗体均未被酶标记；酶是与抗酶抗体结合，避免因共价结合对抗体和酶活性的影响，提高敏感性，节约一抗用量。抗标记物抗体（用与一抗同种动物产生）抗标记物抗体+标记物=免疫复合物(如PAP，APAAP),抗原+一抗+二抗+三抗（PAP，APAAP）单桥法抗原+一抗+二抗（桥抗体）+三抗（抗酶抗体）底物显色双桥法在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，可增大染色强度。特别提示：注意动物种属关系的一致性。葡萄球菌A蛋白法ABC法、SABC、Envision…0103022免疫组化染色基本技术（1）抗体稀释度1）工作液---2）原液---预实验3）抗体浓度选择----控制一定浓度范围（2）抗体滴片技术（3）PBS洗涤1）目的-----保证离子浓度、PH、减少非特异反应2）方法（3）抗体孵育技术湿盒、温度、时间免疫组化染色注意事项：二）免疫组化染色注意事项：①pH：中性及弱碱性反应液和洗涤液：pH7.2-7.4缓冲液配制②离子浓度：低离子浓度：0.01-0.02mol／L缓冲液③去污剂：0.05％Tween200.01%EDTA0.1％-l％TritonX-100可分别加入反应液和染色前洗涤液内第二章免疫组织化学

的基本理论与技术可在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在，从而为研究生命大分子，特别是酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的手段。原理：免疫组织化学(Immunohistochemistry)是利用抗原与抗体特异性结合的原理，使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。010201免疫组织化学的基本理论2免疫组织化学全过程包括:⑴抗原提取⑵抗体制备(博士德,华美,基因公司等购买)⑶抗体标记⑷免疫染色⑸观察分析等过程抗原Ag01定义：是指能刺激机体产生免疫应答，并与相应的免疫产物（抗体）发生特异性结合的物质。02蛋白质：免疫原性最强；03多糖：免疫原性次之；04脂类和核酸：必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。05二、抗原与抗体抗体Ab定义：是机体受到抗原刺激后，