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WB实际条带与预期不符？可算捋顺了

1、目的蛋白以其他形式存在，最常见的情况

翻译后修饰：如糖基化，常见接受糖基化的氨基酸是丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、天冬酰胺（Asn）和羟赖氨酸（Hydroxylysine），例如CD2，根

据uniprot显示，其预测分子量应该在39kda左右，但是表观分子量一般在45kDa左右，这是由于CD2多个位点存在糖基化修饰，实际实验中，如果想探究

分子量差异是否是由糖基化引起的，可以加入糖苷酶PNGaseF切去糖基后，进行WB，而除了糖基化以外，还存在磷酸化，泛素化、甲基化、乙酰化等多种

翻译后修饰。其中，糖基化、乙酰化、甲基化通常是使表观分子量变大，磷酸化通常不变或变大。

CD2理论分子量39kDa左右

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表观分子量45kDa左右

Uniprot中显示CD2的糖基化

剪切：如Caspase-7存在多种形式：

Procaspase-7：Caspase-7的前体形式，分子量约为37kDa。

Intermediatecaspase-7：中间形式的Caspase-7，分子量约为28kDa。

Caspase-7p20：活化的Caspase-7的片段之一，分子量约为20kDa。

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Procaspase-7是Caspase-7的未活化前体形式，具有较大的分子量。当细胞受到凋亡信号刺激时，procaspase通过自身切割或被其他caspase（如initiator

caspases）切割激活，形成较小的活性亚单位这些亚单位结合在一起形成有活性的异二聚体。这种情况可以设置诱导组和非诱导组进行验证

剪切后的表观分子量会变小。

Caspase-7兔单克隆抗体的WB结果

泳道1HeLa全细胞裂解物20ug泳道2Jurkat全细胞裂解物20ug泳道3HEK-293全细胞裂解物20ug二抗：山羊抗兔IgG，(H+L)，

1/10000稀释时缀合的HRP预测分子量：34kDa观察分子量：28,35kDa暴露时间：180s

多聚体和共价结合聚体：如果表观分子量和预测分子量呈现倍数增长，需要考虑是否是多聚体，添加还原剂如DTT可以验证是否为非共价结合聚体。

2、蛋白异常迁移

对于分子量小于20kDa的蛋白

传统的Tris-Glycine体系在用于SDS（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）时，对于小分子量蛋白质的分离效果不佳，主要原因在于以下几个

方面：

离子前峰的影响：在Tris-Glycine体系中，浓缩胶通常使用pH6.8的Tris-HCl缓冲液，而电泳缓冲液和分离胶则使用pH8.3左右的Tris-Glycine缓冲

液。当电泳开始时，甘氨酸（Glycine）在浓缩胶中的解离度较低，移动速度慢，形成一个移动的离子前峰。随着电场的作用，甘氨酸逐渐解离并加速移动，在

这个过程中会产生大量的自由十二烷基硫酸根离子（DS-），这些离子会与小分子量蛋白结合，导致它们聚集或变性，从而影响分辨率。

低分子量蛋白质的迁移问题：由于上述原因，小分子量蛋白质在通过浓