碱性磷酸酶米氏常数的测定.pptVIP

实验八碱性磷酸酶米氏常数的测定

石巍学习分光光度法测定的原理和方法01学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定的原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基酚磷酸为底物时的Km和Vm值。02一、目的要求分光光度法的基本原理及方法二、原理利用吸收光谱对物质进行定性分析原理利用吸收光谱对物质进行定量分析原理1Beer-Lambert（比尔）定律：2T=I/I03A=lg1/T=lgI0/I4A=KCL其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；5K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度601标准曲线法02OD或Ａ03浓度04标准曲线与样品的测定条件必须一致。常用方法01标准管法CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。摩尔吸光系数法C=A/?（?为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。0221酶促反应v-[S]曲线推导出米氏方程为：v其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数435(二)米氏常数的测定原理米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/[S]作图，可得一条直线1/v1/Vm-1/Km1/[S]本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.反应式：pNPP+H2OpNP+HPO42-无色黄色可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。二、分光光度计的使用“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式——透射比（T）、吸光度（A）、已知样品浓度值（C）、已知标准样品斜率（F）01“100%”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)02“0%”键：用于自动调整零透射比03“波长设置”旋钮：用于设置分析波长04仪器操作键介绍样品测试操作3.样品测试操作①打开电源开关，使仪器预热20分钟②用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上③按“方式键”（MODE）将测试方式设置为透射比（T）④将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中⑤打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿和黑体分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖⑥盖好样品室盖，将黑体推或拉入光路，按“0%”键调透射比零⑦将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%”调100.0⑧按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度（A）⑨将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。三、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：管号0123456pNP含量(?mol)00.050.100.150.200.250.300.5?mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.6H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.2Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(m