细胞生物学综合性实验.pptVIP

细胞生物学综合性实验辽宁师范大学生命科学学院那杰动物骨髓细胞染色体标本的制备及NOR的观察骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，可直接观察到分裂细胞，是研究动物细胞遗传学的好材料。细胞生物学综合性实验掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术01观察染色体的数目以及形态特征02熟悉银染法显示动物细胞NOR的原理和方法，并了解NOR在细胞中分布情况03实验目的经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本。银染法可以显示中期染色体上的核仁组织区（NOR）。当NOR在间期转录时，产生一种与转录活动有关的酸性蛋白，此蛋白可保留至中期并能将染液中的银离子还原为金属银而显现为黑色。所以银染法可在中期染色体上显示具有转录活性的NOR数目。而且，染色的深黑程度，还可以反应出基因的活性高低。12实验原理实验材料小白鼠或青蛙天平离心机温箱（或水浴锅）显微镜酒精灯注射器（1ml）解剖盘解剖剪刀片离心管吸管烧杯冰冻载玻片实验仪器、用具Carnoy固定液（现用现配）甲醇：冰醋酸=3：101生理盐水021%秋水仙素溶液用生理盐水配制031/15mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）04Giemsa染液05试剂150%硝酸银溶液氨银溶液：4g硝酸银溶于5ml蒸馏水，再加入5ml浓氨水3%甲醛溶液：3ml36%甲醛液，加蒸馏水97ml，用4g无水醋酸钠调节pH7，4℃保存。使用前用甲酸调pH4.5试剂2实验前3~4h，按动物每克体重2~4μg的剂量，腹腔注射秋水仙素秋水仙素处理1收集骨髓细胞处死动物后，立即取出股骨，用刀片剔掉肌肉，切开股骨两端，用吸有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，直至股骨变白色为止。将收集的骨髓细胞于1000rpm离心10min2动物染色体制备方法和步骤离心后加入600ul蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬液，置37℃低渗20min低渗处理沿管壁逐滴加入固定液600ul，吹打成悬液，室温固定20min，离心。重复此操作一次。最后用500ul固定液将沉淀悬浮。固定动物染色体制备方法和步骤滴片用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2~3滴细胞悬液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥Giemsa染液染色30min，镜检动物染色体制备方法和步骤低渗处理是实验成败的关键01处理和操作过程中注意要有利于细胞完整和染色体的伸展、分散02注意事项01.作业02.绘出骨髓细胞分裂中期染色体核型图指出染色体数目（2n）快速银染法(可选）：01在染色体标本上滴加含1%甲酸的2%明胶水溶液3滴，再加50%硝酸银3滴，混合后盖上盖片，将标本置于60℃恒温台上处理至液体为棕黄色为止，自来水冲洗，空气干燥，镜检。02NOR的显示实验步骤010203040506标本上滴加4-8滴50%硝酸银溶液，立即覆以盖玻片，放入潮湿密封的培养皿中，37℃温箱中24-48h，或50℃2-5h流水冲去盖玻片，蒸馏水洗2次，室温晾干加4d氨银溶液和4d3%甲醛溶液（pH4.5）于染色体标本上，立即覆以盖玻片，室温12min流水冲去盖玻片，蒸馏水洗净2%Giemsa染色10-15min水洗，空气干燥，镜检。氨银染色法（建议）NOR的显示实验步骤