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蛋白质测序技术

＞蛋白质一级结构的测定

•蛋白质的一级结构是蛋白质作用的特异

性、空间结构的差异性和生物学功能多

样性的基础。

•蛋白质的一级结构中除肽键外，有些还

含有二硫键。

蛋白质一级结构

测定的原理

1.氨基酸组成的分析

(1)蛋白质样品的纯化；

(2)蛋白质分子中多肽链数目测定

(3)氨基酸组成的分析

蛋白质一级结构的测定

蛋白质测序测定多肽链的数目

的步骤

拆分多肽链

断开多肽链内的二硫键

测定每一肽链的氨基酸组成

鉴定多肽链的N-末端和C-末端

裂解多肽链为较小的肽段

测定各肽段的氨基酸序列

利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构

确定二硫键的位置

蛋白质一级结构测定基本原则

1.确定蛋白质的纯度在97%以上。

2.测定多肽链的数目。

3.拆分多肽链。

4.分析每一条多肽链的氨基酸组成。

5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端氨基酸残基。

6.用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段。

7.测定各肽段的氨基酸序列。

8.拼接各肽段成完整的多肽链。

9.确定二硫键的位置。

①.多肽链数目的测定

根据蛋白质N端和C端残基的摩尔数和蛋白质的相

对分子质量可确定分子中的多肽链数目。若含一条多

肽链，蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数相等；如果

后者是前者的倍数，说明该蛋白质分子是由多条多肽

链组成。如果检测到的末端基多于一种，表明蛋白质

由两条或多条不同的多肽链组成，即样品是杂多聚蛋

白质(heteromultimericprotein)。

②拆分蛋白质的多肽，可用变性剂聋其

鬻吃黑盘藕整瞟辔藕糠

案大懑产,…可用氧化

Y；；工

荷的不同进行分禺、丁

第4步前予a断裂。

④.测定每一条多肽链的氨基酸组成

分离纯化的多肽链一部分样品完全水解，测定氨基

酸组成，计算氨基酸成分的分子比或各种残基的数目。

⑤.鉴定多肽链的N端和C端残基

多肽链的另一部分样品进行末端残基的鉴定，以便

建立两个重要的氨基酸序列参考点。

⑥.裂解多肽链成较小的片段

用两种或几种不同的断裂方法（指断裂点不一样）

将每条多肽链样品降解成两套或几套重叠的肽段或称肽

碎片。每套肽段进行分离、纯化，并对每一纯化了的肽

段进行氨基酸组成和末端残基的分析。

⑦.测定各肽断的氨基酸序列

最常用Edman降解法，并有自动序列分析仪可供

利用，此外尚有酶解法和质谱法等。

⑧.建立完整多肽链的一级结构

利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间有交错

重叠可以拼凑出原来的完整多肽链的氨基酸序列。

⑨.确定半胱氨酸残基间形成的S-S交联桥的位置

氨基酸序列测定中不包括辅基成分分析，但是它

应属于蛋白质化学结构内容。

2.N-末端氨基酸组成的分析

(1)与2,4-二硝基氟苯的反应(Sanger反应)

在弱碱性溶液中，氨基酸的氨基很容易与

2,4-二硝基氟苯(DNFB)作用，生成稳定的黄

色2,4-二硝基苯基氨基酸(简写为DNP-氨基

酸)。

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