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ELISPOT答疑解惑（三）——错误实验操作退！退！退！

雄赳赳气昂昂的你准备进行ELISPOT检测，

但在实验室里一顿操作猛如虎，最后显色发现一个斑点也没有？

持续2~3天的实验进程，操作步骤那么多，究竟是哪里出了问题？

来，别慌，稳住，我们一起按照实验流程细细排查！

图1：实验workflow

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灵魂叩问1：你的细胞合格吗？

样本质量是实验成功的关键前提，因此在发现实验结果异常时首先应排除细胞质量的问题。

ELISPOT实验样本要求：

·细胞活性≥80%，低于80%可能造成斑点过少、样本的特异性免疫状态/功能不易与阴性或者阳性对照区分；

·细胞数量约为250,000个/孔，需根据实验中细胞的免疫状态进行浓度的调整，若显色结果斑点过多则需适当降低

细胞浓度，反之则需提高细胞浓度；

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友情提示：

·为保证后续在分析实验结果时有据可查，建议上样之前进行细胞活性及浓度数据的记录；

·不要裂红！不要裂红！不要裂红！（裂红操作对细胞活性影响较大，会导致空白结果的出现）；

灵魂叩问2：各个操作步骤的时间有合理安排吗？

ELISPOT实验进程大致在2~3天，其中有抗体孵育、细胞刺激与孵育、显色及干燥等等操作，需要我们对时间安

排有较好的把控，提前进行实验步骤及时间的合理规划是迈向成功的第一步。

自行包被抗体孵育的时间：

捕获抗体的包被，通常需要在4℃下进行过夜孵育；

细胞及刺激剂共孵育的时间：

细胞状态正常情况下，需要在37℃恒温恒湿、5%-9%浓度CO2培养箱中，进行24h的孵育；当细胞活性不足，

或者在前期实验中发现目标细胞因子的分泌水平较低，则需要适当延长孵育时间（≤72h）；当成像结果斑点数过多（eg：

≥500个/孔）时，适当降低孵育时间（≥16h）。

加底物显色及终止的时间：

在观察到肉眼可见的斑点后即可进行终止，显色时间在10~15min内，显色时间过长会导致斑点晕过大、重叠等问

题，可根据实验经验适当调整优化显色终止的时间（10min内亦可）。

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图2：ELISPOT结果[1]

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检测板干燥的时间：

检测板需要彻底干燥，否则背景显色过高会影响最后的成像结果，通常需要在避光条件下倒扣在吸水纸或者台面上

进行24h干燥，或者放置在通风橱以及层流罩中进行2h干燥。

图3：背景过高/阳性过强结果（反面典型，不要学）

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友情提示：

试剂盒中的产品说明书会有相应操作时间的建议，优先遵从说明书要求进行，若实验结果不佳，可进行适度优化和

调整。

灵魂叩问3：对试剂盒的处理及使用是否标准？

试剂盒储存：

在订购试剂盒时需要了解标准储藏条件，保证在正确的条件下保存及使用试剂。

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