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ELISPOT答疑解惑(三)——错误实验操作退!退!退!
雄赳赳气昂昂的你准备进行ELISPOT检测,
但在实验室里一顿操作猛如虎,最后显色发现一个斑点也没有?
持续2~3天的实验进程,操作步骤那么多,究竟是哪里出了问题?
来,别慌,稳住,我们一起按照实验流程细细排查!
图1:实验workflow
△点击放大图片
灵魂叩问1:你的细胞合格吗?
样本质量是实验成功的关键前提,因此在发现实验结果异常时首先应排除细胞质量的问题。
ELISPOT实验样本要求:
·细胞活性≥80%,低于80%可能造成斑点过少、样本的特异性免疫状态/功能不易与阴性或者阳性对照区分;
·细胞数量约为250,000个/孔,需根据实验中细胞的免疫状态进行浓度的调整,若显色结果斑点过多则需适当降低
细胞浓度,反之则需提高细胞浓度;
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友情提示:
·为保证后续在分析实验结果时有据可查,建议上样之前进行细胞活性及浓度数据的记录;
·不要裂红!不要裂红!不要裂红!(裂红操作对细胞活性影响较大,会导致空白结果的出现);
灵魂叩问2:各个操作步骤的时间有合理安排吗?
ELISPOT实验进程大致在2~3天,其中有抗体孵育、细胞刺激与孵育、显色及干燥等等操作,需要我们对时间安
排有较好的把控,提前进行实验步骤及时间的合理规划是迈向成功的第一步。
自行包被抗体孵育的时间:
捕获抗体的包被,通常需要在4℃下进行过夜孵育;
细胞及刺激剂共孵育的时间:
细胞状态正常情况下,需要在37℃恒温恒湿、5%-9%浓度CO2培养箱中,进行24h的孵育;当细胞活性不足,
或者在前期实验中发现目标细胞因子的分泌水平较低,则需要适当延长孵育时间(≤72h);当成像结果斑点数过多(eg:
≥500个/孔)时,适当降低孵育时间(≥16h)。
加底物显色及终止的时间:
在观察到肉眼可见的斑点后即可进行终止,显色时间在10~15min内,显色时间过长会导致斑点晕过大、重叠等问
题,可根据实验经验适当调整优化显色终止的时间(10min内亦可)。
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图2:ELISPOT结果[1]
△点击放大图片
检测板干燥的时间:
检测板需要彻底干燥,否则背景显色过高会影响最后的成像结果,通常需要在避光条件下倒扣在吸水纸或者台面上
进行24h干燥,或者放置在通风橱以及层流罩中进行2h干燥。
图3:背景过高/阳性过强结果(反面典型,不要学)
△点击放大图片
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友情提示:
试剂盒中的产品说明书会有相应操作时间的建议,优先遵从说明书要求进行,若实验结果不佳,可进行适度优化和
调整。
灵魂叩问3:对试剂盒的处理及使用是否标准?
试剂盒储存:
在订购试剂盒时需要了解标准储藏条件,保证在正确的条件下保存及使用试剂。
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