DB37∕T 3532-2019 羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法.docxVIP

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DB37

山东省地方标准

DB37/T3532—2019

羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法

实时荧光PCR法

Identificationofcaprine，sheepandbovinederivedmaterialsingoatorsheepmilk

Real-timefluorescentPCRmethod

2019-03-21发布2019-04-21实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T3532—2019

I

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4原理 1

5试剂和材料 1

5.1试剂 2

5.2材料 2

6仪器设备 2

7检测用引物和探针 3

8试验步骤 3

8.1取样 3

8.2DNA提取 3

8.3实时荧光PCR检测 3

9试验数据处理 4

9.1PCR有效性判定 4

9.2检测结果分析和表述 4

10检测过程中防止交叉污染的措施 4

附录A（规范性附录）实时荧光定性PCR引物/探针序列、反应体系和结果判定 5

附录B（资料性附录）目的基因扩增靶标参考序列 7

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II

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。

本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心。

本标准主要起草人：胡悦、范阳阳、刘艳艳、张全芳、陈雪燕、刘国霞、陈淑娟、谷玉霞、王俊燕步迅。

DB37/T3532—2019

1

羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法

1范围

本标准规定了羊奶产品中羊、牛源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。

本标准适用于生鲜羊奶、灭菌液态羊奶、羊奶粉等羊奶制品中羊、牛源性成分的定性检测。

本方法的检出限为0.1%。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

羊源性

本标准提及的羊源性成分为山羊和绵羊。

3.2

实时荧光PCRreal-timefluorescencePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，对未知模板进行定性或定量分析。

3.3

Ct值cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4原理

根据线粒体16SrDNA基因在不同物种间保守区设计通用引物，在可变区设计物种特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定羊和牛的源性成分。

5试剂和材料

DB37/T3532—2019

2

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。

5.1试剂

5.1.1氯化钠（NaCl）。

5.1.2浓盐酸（HCl）。

5.1.3三羟甲基氨基甲烷（Trisbase）。

5.1.4二水乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）。

5.1.5十二烷基硫酸钠（SDS）。

5.1.6磷酸盐缓冲液（PBS）。

5.1.7异硫氰酸胍（GuSCN）。

5.1.8硅珠（silica）。

5.1.9蛋白酶冻干品。

5.1.10聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）。

5.1.11无水乙醇。

5.1.12Chelex-100树脂。

5.2材料

5.2.1生理盐水：称取0.85g氯化钠加20mL水溶解，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4KPa蒸汽压（121℃)灭菌20min，降至室温，4℃保存备用。

5.2.220mg/mL蛋白酶K溶液：称取0.2g蛋白酶冻干品，转移至10mL容量瓶中，加水定容至刻度，

分装后于-20