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猫泛白细胞减少症病毒XJ1-05株的分离及鉴定

一、引言

(1)猫泛白细胞减少症（FelinePanleukopenia，FPV）是由猫泛白细胞减少症病毒（FelinePanleukopeniaVirus，FPV）引起的一种高度传染性疾病。该病毒属于细小病毒科，对猫及其他食肉动物具有致病性。FPV感染可导致严重的消化系统症状，如呕吐、腹泻、厌食等，甚至可引起急性死亡。近年来，FPV在我国宠物猫中流行，给宠物主人带来了巨大的经济损失和情感困扰。因此，研究FPV的分离与鉴定对于控制该病毒在我国宠物猫中的传播具有重要意义。

(2)FPV的分离与鉴定是研究该病毒的重要步骤，它有助于了解病毒的生物学特性、致病机制以及疫苗研发等。目前，FPV的分离方法主要包括细胞培养和动物感染。其中，细胞培养法操作简便、成本低廉，是实验室常用的分离方法。而动物感染法则可模拟自然感染过程，有助于研究病毒的致病性和免疫学特性。FPV的鉴定主要通过检测病毒核酸、抗原以及病毒粒子的形态等手段进行。

(3)本研究旨在分离和鉴定猫泛白细胞减少症病毒XJ1-05株，探讨该病毒的生物学特性及致病机制。通过细胞培养法分离FPV，利用分子生物学技术检测病毒核酸，并结合病毒抗原检测和形态学观察进行鉴定。此外，本研究还将对分离到的病毒进行致病性实验，分析其与宿主细胞的相互作用，为FPV的防控和疫苗研发提供理论依据。

二、材料与方法

(1)实验材料包括健康猫粪便样本、猫肾细胞（CAT-K1）、DMEM培养液、胎牛血清、青霉素、链霉素、病毒核酸提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、引物和探针等。粪便样本来自疑似FPV感染猫，经初步临床诊断后采集。CAT-K1细胞购自中国科学院细胞库，用于病毒分离培养。DMEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司，青霉素和链霉素购自中国北京Solarbio公司。病毒核酸提取试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自中国天根生化科技有限公司。引物和探针由上海生物工程公司合成，针对FPV的VP2基因设计。

(2)病毒分离培养采用CAT-K1细胞，将粪便样本稀释后接种于细胞单层，37℃、5%CO2条件下培养。观察细胞病变效应（CPE），当出现典型CPE时，收集细胞悬液，重复冻融三次以裂解细胞释放病毒。收集的病毒悬液进行盲传，每隔24小时观察CPE，直至连续三天出现典型CPE为止。收集病毒培养物，用于后续的病毒鉴定和致病性实验。实验过程中，同时设立阴性对照和阳性对照，以排除其他因素对实验结果的影响。

(3)病毒鉴定采用荧光定量PCR技术检测病毒核酸。首先，提取病毒培养物中的总RNA，使用病毒核酸提取试剂盒进行提取。然后，利用荧光定量PCR试剂盒和引物、探针进行FPVVP2基因的扩增。实验设置三个复孔，每个复孔加入50μl反应体系。扩增条件为：95℃预变性30秒，95℃变性5秒，60℃退火延伸30秒，共40个循环。通过分析Ct值和扩增曲线，判断病毒核酸的存在。实验过程中，设置阴性对照和阳性对照，确保实验结果的准确性。同时，对分离到的病毒进行形态学观察，使用电子显微镜观察病毒粒子形态，以进一步确认病毒分离成功。

三、病毒分离与纯化

(1)病毒分离实验开始于将疑似FPV感染猫的粪便样本进行10倍梯度稀释。稀释后的样本接种于猫肾细胞（CAT-K1）单层，每个稀释度接种三个平行孔，每个孔接种量100μl。接种后，将细胞培养板置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。在接种后的24小时内，密切观察细胞病变情况。在培养第48小时，观察到部分细胞出现典型的细胞圆缩、脱落等现象，表明病毒可能已成功分离。

(2)为了进一步确认病毒分离的成功，对出现细胞病变的孔进行连续传代培养。在第3代传代培养中，观察到更为明显的细胞病变效应，包括细胞膜破裂、细胞核变形等。此时，收集含有病毒的细胞培养物，进行病毒纯化。纯化过程包括三次冻融裂解细胞，以释放病毒颗粒。每次裂解后，通过400nm滤膜过滤病毒悬液，去除细胞碎片和大分子物质。

(3)纯化后的病毒悬液再次接种于新的CAT-K1细胞单层，进行盲传培养。经过连续3天的盲传培养，观察到病毒在细胞中复制并引起细胞病变。在此过程中，病毒滴度逐渐升高，最终达到10^6.5TCID50/ml。为了验证病毒纯化效果，对纯化后的病毒进行形态学观察。使用电子显微镜观察病毒粒子，结果显示病毒颗粒呈球形，直径约20-25nm，符合FPV的形态特征。此外，对纯化后的病毒进行PCR检测，结果显示扩增出预期的FPVVP2基因片段，进一步证实了病毒分离与纯化的成功。

四、病毒鉴定

(1)对分离纯化的猫泛白细胞减少症病毒XJ1-05株进行鉴定，首先采用荧光定量PCR技术检测病毒核酸。实验中，设计针对FPVVP2基因的特异性引物和探针，通过优化PCR反应条件