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保定地区传染性支气管炎病毒S1基因遗传变异分析

一、研究背景与意义

(1)传染性支气管炎病毒（IBV）是一种常见的禽类呼吸道病原体，对全球养禽业造成巨大的经济损失。其中，S1基因编码的病毒表面蛋白在病毒吸附宿主细胞过程中发挥关键作用，因此，对S1基因的研究对于理解病毒致病机制和开发有效的防控措施具有重要意义。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，对IBVS1基因的遗传变异研究逐渐深入，揭示了其变异规律和进化趋势。然而，在我国保定地区，IBV的流行情况复杂，病毒株之间存在广泛的遗传差异，有必要对其进行深入研究。

(2)保定地区作为我国重要的养禽生产基地，近年来IBV的流行形势日益严峻，给当地养殖业带来了巨大的经济损失。因此，研究保定地区IBVS1基因的遗传变异特征，对于揭示病毒在当地的流行规律、预测病毒变异趋势以及制定有效的防控策略具有重要意义。通过对S1基因的序列分析，可以了解病毒株之间的遗传关系，为疫苗研发和免疫监测提供科学依据。

(3)此外，IBVS1基因的遗传变异还可能影响病毒的致病性和免疫逃逸能力。因此，研究保定地区IBVS1基因的遗传变异，有助于揭示病毒在宿主体内的致病机制，为新型抗病毒药物的研发提供理论支持。同时，通过对S1基因变异的研究，可以评估疫苗的保护效果，为优化疫苗配方提供参考。总之，开展保定地区IBVS1基因遗传变异分析，对于保障我国养禽业的健康发展具有重要意义。

二、研究方法与材料

(1)本研究采用高通量测序技术对保定地区分离的IBV病毒株进行S1基因全序列分析。首先，从临床样品中分离出IBV病毒，并通过RT-PCR技术扩增S1基因片段。然后，利用IlluminaHiSeq2500平台进行高通量测序，获取S1基因的核苷酸序列。测序数据经过质量控制、比对和组装后，获得完整的S1基因序列。具体操作流程如下：首先，从保定地区不同养殖场采集疑似IBV感染的鸡支气管分泌物样本，共收集样本100份。通过RT-PCR技术扩增S1基因片段，使用引物F:5-GATGAGACATCGATGGTACG-3和R:5-TCCAGCGGCAATGACGAGTC-3。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，35个循环（95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟），最后72℃延伸10分钟。PCR产物经过电泳检测，选取特异性条带进行测序。

(2)在获得S1基因序列后，采用BLAST程序在NCBI数据库中进行同源性比对，以确定病毒株的分类。同时，利用MEGA7.0软件进行序列比对和进化树构建，分析S1基因的遗传变异和进化趋势。通过比对结果显示，100个病毒株中，有80个属于A亚群，15个属于B亚群，5个属于C亚群。进一步分析发现，A亚群病毒株在保定地区的流行率最高，且S1基因存在多个单核苷酸多态性（SNPs）位点。以A亚群中的一个病毒株为例，其S1基因序列与参考序列相比，共有15个SNPs位点，其中7个位于免疫原性区域。

(3)为了进一步研究S1基因的遗传变异对病毒致病性的影响，本研究采用细胞培养实验和动物感染模型。首先，将S1基因突变病毒株接种于MDCK细胞中，观察细胞病变情况。结果显示，突变病毒株在细胞培养中表现出较强的致病性，与野生型病毒株相比，病毒滴度提高了2倍。接着，将突变病毒株接种于SPF鸡胚中，观察鸡胚的发育情况。结果显示，突变病毒株感染鸡胚后，鸡胚死亡率显著高于野生型病毒株，死亡率达到80%。此外，我们还对感染突变病毒株的鸡进行了免疫保护实验，结果显示，接种突变病毒株疫苗的鸡在攻毒后，血清中IBV抗体水平显著高于接种野生型病毒株疫苗的鸡。这些结果表明，S1基因的遗传变异对病毒的致病性和免疫逃逸能力具有显著影响。

三、结果与分析

(1)通过对保定地区100个IBV病毒株S1基因的测序和比对分析，我们发现这些病毒株呈现出显著的遗传多样性。在S1基因中，共检测到超过100个SNPs位点，其中一些位点位于与病毒致病性和免疫逃逸相关的关键区域。具体来看，位于S1蛋白N端保守区域的一个SNP位点（位点位置为第123位，从N端开始计数）在所有病毒株中均有突变，且突变频率高达90%。这一突变位点可能通过改变S1蛋白的结构，从而影响病毒的吸附和入侵宿主细胞的能力。

(2)在进化树分析中，保定地区的IBV病毒株与全球其他地区的病毒株形成了不同的进化分支，表明保定地区的病毒株可能经历了独立的选择压力。此外，通过比较不同病毒株的S1基因序列，我们发现一个特定的SNP位点（位点位置为第254位）与病毒的免疫逃逸能力密切相关。在突变型病毒株中，该位点突变频率为75%，而在野生型病毒株中仅为15%。这一发现提示我们，该位点可能是一个重要的免疫逃逸位点，需要进一步研究其影响病毒免疫原性的具体机制。

(3)在细胞培养实