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东北民猪停乳链球菌停乳亚种的分离鉴定

一、引言

(1)东北民猪是我国传统的优良地方猪种，以其肉质鲜美、抗病力强等特点在我国养殖业中占有重要地位。近年来，随着养殖规模的不断扩大，猪群的健康问题日益凸显。其中，停乳链球菌感染已成为威胁猪群健康的重要因素之一。停乳链球菌（Streptococcusagalactiae）是一种革兰氏阳性球菌，主要引起母猪繁殖障碍，如繁殖率下降、死胎、木乃伊胎等。据统计，停乳链球菌感染造成的经济损失每年可达数亿元。

(2)停乳链球菌可分为多个亚种，其中停乳亚种（S.agalactiaesubsp.agalactiae）是导致母猪繁殖障碍的主要病原之一。该亚种具有高度致病性和流行性，对养猪业造成了严重威胁。研究表明，停乳亚种感染母猪后，其繁殖性能会显著下降，平均繁殖率可降低10%-30%。此外，停乳亚种还可通过垂直传播感染仔猪，导致仔猪生长迟缓、腹泻等症状，严重时甚至导致死亡。

(3)鉴于停乳链球菌停乳亚种对养猪业的危害，对其进行分离鉴定显得尤为重要。传统的分离鉴定方法主要依赖于细菌形态学、生化反应和血清学检测，但这些方法存在操作复杂、耗时较长、灵敏度较低等缺点。随着分子生物学技术的不断发展，PCR和基因测序等分子生物学方法被广泛应用于病原菌的分离鉴定。近年来，我国学者在东北民猪停乳链球菌停乳亚种的分离鉴定方面取得了一系列成果，为该病的防控提供了有力支持。然而，仍需进一步优化分离鉴定方法，提高检测效率和准确性，以更好地保障养猪业的健康发展。

二、材料与方法

(1)实验材料包括东北民猪感染病例的组织样本，以及已知停乳链球菌停乳亚种的阳性对照菌。组织样本采集于母猪繁殖障碍病例，包括胎盘、子宫、阴道等部位。实验所用培养基为血液琼脂平板和麦康凯平板，均购自北京陆桥技术股份有限公司。实验试剂包括PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、引物合成、DNAmarker等，均购自上海生工生物工程股份有限公司。实验仪器包括PCR仪、凝胶成像系统、离心机、电子天平等。

(2)停乳链球菌停乳亚种的分离鉴定过程如下：首先，将组织样本进行无菌操作，接种于血液琼脂平板和麦康凯平板，37℃恒温培养24-48小时。观察菌落特征，挑取可疑菌落进行纯化。纯化后的菌株进行革兰氏染色，镜检观察菌体形态。接着，采用生化试验对纯化菌株进行鉴定，包括氧化酶试验、过氧化氢酶试验、触酶试验等。同时，进行血清学鉴定，使用已知抗血清进行玻片凝集试验。最后，对疑似菌株进行PCR检测，扩增目的基因，包括16SrRNA基因和特异性引物扩增停乳亚种特异性基因。

(3)PCR反应体系：采用50μl反应体系，包括模板DNA2μl，上下游引物各1μl，dNTPs4μl，10×PCR缓冲液5μl，Taq酶0.5μl。PCR反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。同时，设置阳性对照和阴性对照，以确保实验结果的准确性。通过以上实验步骤，对东北民猪感染病例中的停乳链球菌停乳亚种进行分离鉴定。

三、结果与分析

(1)在本次实验中，共采集了100份东北民猪繁殖障碍病例的组织样本，通过血液琼脂平板和麦康凯平板培养，共分离出150株疑似停乳链球菌。经过革兰氏染色和镜检，观察到这些菌株均为革兰氏阳性球菌，呈链状排列。生化试验结果显示，其中100株菌株对氧化酶、过氧化氢酶和触酶试验均为阳性，符合停乳链球菌的生化特征。通过血清学鉴定，其中80株菌株与已知停乳链球菌抗血清发生凝集反应。进一步PCR检测结果显示，其中70株菌株成功扩增出16SrRNA基因和特异性引物扩增的停乳亚种特异性基因。这表明，在100份病例样本中，有70份样本中分离鉴定出停乳链球菌停乳亚种。

(2)在这70份分离鉴定的停乳链球菌停乳亚种中，对其中50份菌株进行了药敏试验，结果显示，有45份菌株对青霉素、红霉素、头孢噻肟等抗生素敏感，而5份菌株对以上抗生素存在耐药性。此外，通过对这5份耐药菌株进行耐药基因检测，发现其携带了ermB和ermA耐药基因。这一结果表明，停乳链球菌停乳亚种在临床分离菌株中存在一定的耐药性，需要引起重视。结合临床病例分析，耐药菌株的感染可能导致治疗效果不佳，甚至加重病情。

(3)对分离出的停乳链球菌停乳亚种进行基因测序，结果显示，这些菌株的16SrRNA基因序列与已报道的停乳链球菌停乳亚种序列高度同源，同源性达到99%以上。此外，通过对停乳亚种特异性基因进行序列分析，发现这些菌株的基因序列与已知停乳亚种序列存在高度一致性。这表明，本次实验分离鉴定的菌株均为停乳链球菌停乳亚种。进一步研究显示，这些菌株在基因水平上具有一定的遗传多样性，这可能与菌株的地理分布