质粒DNA的提取与检测.pptVIP

分次收集4ml菌液离心，留沉淀第二部分琼脂糖凝胶电泳相关知识电泳：泳动速度决定于？琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度依次为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。影响迁移率的因素DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压（一般5V/cm）、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。*动画效果*有链接！！！！*不质粒DNA的提取及检测薛亚男是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等质粒的复制：严紧型复制（1~n个）松弛型复制（20个以上）质粒（plasmid）常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18,pUC19Ampr抗性基因Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA质粒提取的思路凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第一部分质粒DNA的提取实验目的实验原理附：原理示意图试剂操作步骤1器材注意事项操作步骤2操作步骤3目录返回标题一．目的了解提取质粒的原理。学习和掌握质粒提取的方法和技术。 ——三个基本步骤：细菌的生长和质粒的扩增菌体的收集裂解及质粒DNA的分离质粒DNA的纯化返回目录碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。返回目录在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。12345二．原理原理示意图返回目录返回原理仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅材料：含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌、试剂：LB培养基（液体、固体）溶液I溶液II溶液IIITE(pH8.0)三、实验仪器、材料与试剂器材1.恒温摇床2.超净工作台3.离心机4.电泳仪和电泳槽5.玻璃器皿与耗材量筒、三角瓶、平皿;EP管(1.5ml,0.5ml);枪头(1ml,0.2ml,10μl);牛皮纸、纱布、牙签等返回目录试剂1.LB培养基detail2.溶液Idetail3.溶液Ⅱdetail4.溶液IIIdetail5.TE(pH8.0)detail返回目录配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入：细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeastextract)5gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/LNaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。LB培养基backmmol/L葡萄糖mmol/LEDTA(pH8.0)作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。mmol/LTris·Cl(pH8.0)溶液Iback